刘泽烨,薄涛,许静,王伟

(山西大学 生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原,030006)

0 引言

金属硫蛋白(Metallothionein)富含半胱氨酸[1],是动物、植物和微生物中广泛存在的一类小分子蛋白[2],通过巯基与金属离子相互作用[3],具有螯合金属离子能力。根据氨基酸序列、半胱氨酸残基分布和序列相似性,可将金属硫蛋白分为15个家族[4]。金属硫蛋白具有重金属解毒[5],调节细胞内金属离子稳态[6]和活性氧清除[7]的功能。金属硫蛋白高级结构呈无序状态;与金属离子结合后,会折叠为有序结构[8]。

金属硫蛋白氨基酸序列在高等真核生物中具有较高的保守性,但在其他生物中,其氨基酸序列存在较大差异。目前对金属硫蛋白的研究主要集中在高等真核生物和原生动物中,如哺乳类、甲壳类、植物[5]、原生生物四膜虫[9]等。而关于藻类金属硫蛋白以及对藻类重金属离子解毒机制的相关研究较少[10]。藻类作为水体中的初级生产者,分布范围广,适应性强,在水生生态系统食物链中占有十分重要的地位[11]。藻类常被用来进行水环境检测、水体生态修复和治理[12]。金藻(Poterioochromonasmalhamensis)是一种广泛分布的淡水藻类,在淡水环境中是细菌和浮游藻类的捕食者;当环境中缺少饵料生物时,它亦能够以光合自养方式进行生长和繁殖[13]。

本研究首次从金藻中鉴定了一种新的PmCRP1基因,分析了PmCRP1基因对金属离子的响应;构建重组质粒pSUMO-PmCRP1,获得PmCRP1的原核重组表达;表明重组PmCRP1的大肠杆菌金属提高了对离子耐受性,PmCRP1可能为一类新型的金属硫蛋白。

1 材料与方法

1.1 细胞株和质粒

金藻由中科院水生生物研究所龚迎春博士惠赠。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)为本实验室保存,pE-SUMO原核表达载体为本实验室保存,pMD18-T载体购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试剂

Taq DNA Polymerace，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶BamH Ⅰ，XhoⅠ(Thermo Scientific公司)；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(北京天根生化公司)；蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂粉(生工生物工程股份有限公司)；引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 金藻细胞培养

藻种培养用AF-6培养基,培养基组成参考宋立荣等[13],培养温度20 ℃,光照强度约100 μmol·m-2·s-1。

1.4 PmCRP1基因的鉴定及表达分析

以金藻基因组为模板,扩增PmCRP1基因(引物见表1)。将在AF-6培养基中生长的金藻用Tris-HCl清洗两次,并在Tris-HCl中继续培养36 h。分别用1 μg/mL的Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+诱导4 h,Trizol法提取总RNA,反转录获得cDNA。以cDNA为模板,进行qRT-PCR分析。PmCRP1基因和18srRNA内参基因的引物见表1。每个样本取3个平行,结果通过StepOne Software 软件读取及采用相对CT 法处理分析。统计方法采用t检验,P<0.05 具有统计学意义。

表1 引物序列

1.5 PmCRP1重组质粒的构建

PCR扩增的PmCRP1基因与pMD-18T载体连接,获得pMD-18T-PmCRP1重组质粒。将pMD-18T-PmCRP1与pE-SUMO质粒用BamH Ⅰ和XhoⅠ进行双酶切，回收酶切产物，将酶切产物PmCRP1与pE-SUMO连接，获得重组质粒pSUMO-PmCRP1。经PCR和双酶切初步鉴定后，上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.6 SUMO-PmCRP1融合蛋白在大肠杆菌中的表达和Western blotting分析

将重组质粒pSUMO-PmCRP1转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1菌株在LB液体培养基中培养至对数生长期,0.05 mmol/L IPTG，37℃诱导表达5 h，10 000 r/min，4℃离心5 min收集菌株，将菌株重悬于1 × PBS缓冲液中，超声破碎仪破碎菌体，收集全菌液和上清液，12% SDS-PAGE电泳分析。蛋白样品12% SDS-PAGE电泳后, 100 V，35 min转至PVDF膜。5%的脱脂奶粉封闭1 h，鼠源Anti-His(1∶500稀释)4℃过夜孵育，羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)作二抗，室温下摇床孵育1 h，避光显影。

1.7 重组大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1金属离子耐受性分析

大肠杆菌菌株BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1,分别在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养至OD600=0.6后,加入0.05 mmol/L IPTG,180 rpm，37℃诱导5 h。分别将上述两种重组大肠杆菌转移至新的含有50 μg/mL卡那霉素5 mL LB培养基中,使其终浓度为OD600=0.2,并分别加入不同浓度的CuSO4,CdCl2或ZnSO4, Cu2+浓度为0、1、2、3、4、5、6、8、10 mmol/L;Cd2+和Zn2+为0、100、200、300、400、500、600、700、800、1 000 μmol/L,37 ℃,180 r/min摇床培养5 h。10 000 r/min,4℃离心1 min收集1 mL菌液,去上清,用1 mL的无菌超纯水重悬菌株。用分光光度计法,测定不同金属离子浓度下,重组大肠杆菌的生长曲线。每组实验重复3次,统计方法采用t检验,P<0.05具有统计学意义。TeMTT2可以显著提高大肠杆菌BL21/pSUMO-TeMTT2对Cd2+的耐受性[14]。将大肠杆菌BL21/pSUMO、BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1分别在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养至OD600=0.6, 0.05 mmol/L IPTG,180 rpm,37℃诱导4 h。分别将上述三种重组大肠杆菌转移至新的含有50 μg/mL卡那霉素5 mL LB培养基中,使其终浓度为OD600=2.0,在含有200 μmol/L CdCl2的LB固体培养基上划线,37℃孵育24 h。

2 实验结果

2.1 PmCRP1基因鉴定及PmCRP1蛋白序列分析

以金藻基因组为模板,扩增获得PmCRP1基因(396 bp)(图1A)。通过ProtParam在线工具(http:∥web.expasy.org/protparam)对PmCRP1蛋白质一级结构及理化性质进行分析。PmCRP1全长131个氨基酸(图1B),分子质量14.28 kD,等电点5.02。PmCRP1与金属离子结合相关氨基酸29个,其中Cys 26个, His 3个,Cys占整个蛋白质的19.85 %。不同金属硫蛋白家族中,对极性带电荷氨基酸Lys和Arg,与极性不带电荷氨基酸Ser和Thr的偏爱性不同。在PmCRP1中,有9个Lys,不含Arg;以及含有7个Ser和2个Thr。PmCRP1具有与金属硫蛋白家族类似的半胱氨酸基序,其中含有1个CCC、1个CXCC、2个XCCX、2个CXC和7个XXCXX半胱氨酸基序(图1C)。通过SignalP在线工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对PmCRP1的信号肽序列进行预测分析,结果显示无信号肽。通过NCBI Blastp 在线比对工具对PmCRP1氨基酸序列进行比对分析,结果显示,PmCRP1同源蛋白为未知的功能蛋白。PmCRP1富含半胱氨酸,无信号肽,具有典型的金属硫蛋白半胱氨酸基序,可能具有金属硫蛋白生物学功能。

A. PmCRP1基因鉴定,Mr为Trans 2K DNA Marker,1:以金藻基因组为模板的PmCRP1的PCR扩增产物; B. PmCRP1氨基酸序列,Cys残基以红色显示;C. 不同金属硫蛋白家族中,His残基和Cys基序(其中X是任何氨基酸和C半胱氨酸残基)的分布,灰色框表示存在于对应金属硫蛋白家族中, 白色框表示不存在,数字代表存在于PmCRP1中His残基和Cys基序的个数;Fig.1 Identification of PmCRP1 and sequence analysis of PmCRP1 protein图1 PmCRP1基因的鉴定及PmCRP1蛋白的序列分析

2.2 金属离子诱导对PmCRP1基因表达的影响

为了分析PmCRP1基因的功能,通过qRT-PCR分析金属离子胁迫下该基因的表达水平。在不添加金属离子的对照组中,PmCRP1基因表达量最高。在培养基中加入1 μg/mL Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+,PmCRP1基因表达量均显著下降(图2)。

qRT-PCR分析Cd2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+(1 μg/mL)诱导下PmCRP1基因的表达, 星号表明不同处理组之间存在显著性差异,*P<0.05,**P<0.01, 每个样本设有三个平行Fig.2 Expression analysis of PmCRP1 induced by different metal ions图2 PmCRP1基因在不同金属离子诱导下的表达分析

2.3 pSUMO-PmCRP1重组质粒的构建及鉴定

为了进一步分析PmCRP1蛋白的功能,首先构建了大肠杆菌pSUMO-PmCRP1重组质粒,将PmCRP1基因连接到含有SUMO标签的原核表达载体上,构建pSUMO-PmCRP1原核表达质粒(图3A)。经PCR和双酶切鉴定(图3B),测序结果表明pSUMO-PmCRP1表达质粒构建成功。

A.重组质粒pSUMO-PmCRP1构建示意图;B.重组质粒pSUMO-PmCRP1的鉴定, Mr为Trans 2K DNA Marker,1:pSUMO-PmCRP1质粒,2:PmCRP1基因的PCR扩增产物, 3:pSUMO-PmCRP1质粒的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切产物Fig.3 Construction and identification of recombinant plasmid pSUMO-PmCRP1图3 重组质粒pSUMO-PmCRP1的构建及鉴定

2.4 SUMO-PmCRP1融合蛋白在大肠杆菌中的表达

质粒pSUMO和pSUMO-PmCRP1分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后, IPTG诱导表达,诱导后产生20 kDa 左右的SUMO蛋白条带和34 kDa的蛋白条带,该蛋白的表达量占总蛋白的12.8%(图4A)。诱导后的BL21/pSUMO-PmCRP1重组大肠杆菌裂解液经Western blotting分析(图4B),重组融合蛋白特异性地与Anti-His抗体反应。结果表明,SUMO-His-PmCRP1获得融合表达。

A. 融合蛋白SUMO-PmCRP1的表达,M为ProteinRuler II, 1:未经IPTG诱导的BL21/pSUMO重组大肠杆菌裂解液, 2:经IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21/pSUMO裂解液, 3:经IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21/pSUMO上清液, 4:未经IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1裂解液, 5:经IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1裂解液, 6:经IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1上清液; B. SUMO蛋白及融合蛋白SUMO-PmCRP1的Western blotting分析Fig.4 Expression analysis of fusion protein SUMO-PmCRP1 in Recombinant E. coli图4 融合蛋白SUMO-PmCRP1在重组大肠杆菌中的表达分析

2.5 重组大肠杆菌BL21/pSUMO-PmCRP1对Cd2+、Cu2+、Zn2+的耐受性分析

为了研究BL21/pSUMO-PmCRP1重组大肠杆菌对Cd2+,Cu2+和Zn2+金属离子耐受性,将pSUMO和pSUMO-PmCRP1质粒分别转化大肠杆菌BL21。当Cd2+浓度大于200 μmol/L时, BL21/pSUMO-PmCRP1菌株对Cd2+耐受性显著提高;其中,在Cd2+浓度为500 μmol/L时,实验组比对照组菌株浓度提高了120%;当Cd2+浓度继续升高时,Cd2+引起的胁迫显著上升,无论是对照组还是BL21/pSUMO-PmCRP1重组大肠杆菌浓度都显著下降(P<0.05)(图5A)。当Cu2+浓度为3 mmol/L时,BL21/pSUMO-PmCRP1菌株相比对照组对Cu2+耐受性提高显著(P<0.05),其中实验组比对照组菌株浓度提高了17%(图5B)。当Zn2+浓度在200-800 μmol/L之间时,BL21/pSUMO-PmCRP1菌株对Zn2+耐受性显著提高(P<0.05);其中,Zn2+浓度为300 μmol/L时,两种菌株浓度差异最大,实验组比对照组菌株浓度提高了20%倍(图5C)。

通过平板划线法进一步分析Cd2+对BL21/pSUMO,BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1重组大肠杆菌生长的影响。将三种重组大肠杆菌在含有200 μmol/L CdCl2的LB固体培养基上划线。结果显示,阳性对照组BL21/pSUMO-TeMTT2菌株和实验组BL21/SUMO-PmCRP1菌株都可以增殖。 BL21/SUMO-PmCRP1菌株表现出更强的Cd2+耐受性(图5D)。

A.重组大肠杆菌BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1在、100、200、300、400、500、600、 800、1 000 μmol/L浓度的Cd2+胁迫下生长5 h后的增殖;B.重组大肠杆菌BL21/pSUMO和 BL21/pSUMO-PmCRP1在、1、2、3、4、5、6、8、10 mmol/L浓度的Cu2+胁迫下 生长5 h后的增殖;C.重组大肠杆菌BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1在、100、200、300、 400、500、600、800、1 000 μmol/L浓度的Zn2+胁迫下生长5 h后的增殖; D. 重组大肠杆菌BL21/pSUMO,BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1 在200 μmol/L CdCl2LB固体培养基的增殖Fig.5 Analysis of metal ion tolerance of recombinant E.coli BL21/pSUMO-PmCRP1图5 BL21/pSUMO-PmCRP1重组大肠杆菌金属离子耐受性分析

3 分析与讨论

富含半胱氨酸蛋白是动植物中存在的一类小分子蛋白,在生物体内具有广泛的生物学功能,例如调节植物生长发育、防御、蛋白酶抑制、重金属解毒等[1]。金属硫蛋白是富含半胱氨酸蛋白中的一大类,能与金属离子结合[15]。在金属硫蛋白家族间,除了一些共同的结构特征之外,金属硫蛋白家族之间整体序列保守性不高,这表明不同的金属硫蛋白家族可能在进化过程中多次独立发生,共同的结构特征是多次趋同进化的结果[4]。目前鉴定的大多数真核生物金属硫蛋白来自有限的生物类群,并不能真实反映全部金属硫蛋白的多样性[16]。本实验室在游仆虫转录组中意外获得的一种编码富含半胱氨酸蛋白基因, 序列分析发现该基因为金藻基因组特异序列,我们并不清楚该基因是金藻与游仆虫共生的产物还是培养中金藻污染的结果。然而通过PCR扩增,在纯培养的金藻中克隆出该基因,发现其编码的PmCRP1蛋白质具有一些广泛存在于金属硫蛋白中的半胱氨酸基序[2]。其半胱氨酸排列形式有CCC,CXCC,XCCX,CXC,XXCXX(C是Cys; X是Cys以外的任何氨基酸残基),无信号肽,这些特征与金属硫蛋白相似。PmCRP1与目前已发现的金属硫蛋白家族具有共同特征,但也表现出其自身特点,无法归入现有的15个金属硫蛋白家族中,这可能是一种新的金属硫蛋白。

编码金属硫蛋白的基因中一般不含有内含子,PmCRP1基因也不含内含子,这可能与金属硫蛋白快速诱导表达响应水体环境中的重金属离子相似[8]。但本研究结果表明,金属离子并不能诱导PmCRP1上调。在种类极其丰富的金属硫蛋白家族中,并非所有的金属硫蛋白基因都能被金属离子诱导表达上调,如黄瓜茎中金属硫蛋白CsMTL2基因也不能被金属离子诱导上调[17]。虽然金属离子不能诱导PmCRP1基因表达上调,但PmCRP1可以与Cd2+、Cu2+、Zn2+等金属离子结合。在PmCRP1中,带电残基Lys的数量明显占优势,这对金属结合亲和力十分重要,特别是金属硫蛋白在细胞基础代谢过程中充当金属分子伴侣时[18]。

经典的金属硫蛋白首次从马肾中分离出来,具有较强的Cd2+解毒特性[19],多数的金属硫蛋白被普遍认为可以解除Cd2+的毒性和维持金属离子稳态[20]。本研究中,表达PmCRP1的大肠杆菌对Cd2+的耐受性水平高于对照组,表明PmCRP1的表达通过结合环境中的Cd2+,从而增强细胞对Cd2+的耐受性。与表达四膜虫金属硫蛋白TeMTT2的菌株相比,表达PmCRP1的菌株具有更高的Cd2+耐受性(图5D)。结果暗示PmCRP1具有金属离子结合特性,可能是一种新的金属硫蛋白。这为进一步挖掘新的金属硫蛋白及其功能提供了新的数据。