彭 浩， 吴 畏， 师艳秋， 王 贤， 宋文路

(1.济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜 273155； 2.山东凯斯达机械制造有限公司，山东济宁 272000)

香菇[Lentinusedodes(Berk.) Sing]为担子菌纲伞形科真菌，是世界上重要的食用菌兼药用菌之一。人们将真菌多糖作为药物进行研究始于20世纪50年代，在20世纪60年代以后，真菌多糖作为免疫促进剂受到广泛关注，其中香菇多糖(lentinan，简称LNT)是研究得较为透彻的多糖之一[1]。LNT具有抗肿瘤[2]、抗病毒[3]、提高免疫力[4]、抗氧化[5]和刺激干扰素形成等功能，是一种重要的生理活性物质，因而被广泛地应用于药品、食品保健等行业中。

目前，关于LNT提取的研究较多。提取LNT的经典方法为水提醇沉法，该法成本低廉、易于操作、工艺简明。但是，热水浸提法采用的浸提温度为70～80 ℃，耗能多，提取时间长，提取率低。另一类常见的提取方法为酸法、碱法，但提取过程不容易控制反应条件，且酸碱浓度过高时会有腐蚀性，多糖结构极可能遭到破坏，导致香菇多糖分子量下降，造成其生物活性的降低。目前，多种新技术如超声波辅助提取、微波辅助提取、酶法辅助提取、半仿生提取的使用在一定程度上弥补了传统工艺的缺陷[6-7]。其中，微波预处理-超声波提取法[8]能较好地结合微波提取法和超声波提取法两者的优点，利用微波的热效应(内加热)使原料的细胞壁和细胞膜迅速溶胀破裂，再利用超声波的空化效应和机械效应使溶剂快速渗入细胞内部，从而使有效成分迅速溶解并快速离开细胞膜和细胞壁，进入主体溶剂。微波预处理-超声波提取法既能快速高效地提取物料中的有效成分，也能避免微波作用时间过长而引发的不良效果，确保有效成分最大限度地被提取，是一种极具发展潜力的新型提取技术[5]。

目前已有关于微波预处理-超声波提取山茱萸多糖及其稳定性研究的报道[9]，也有关于经微波预处理-超声波提取的LNT抗氧化活性的研究[5]，且后者在固定微波和超声波功率条件下对微波时间等条件进行了优化。本研究以香菇多糖提取率为指标，在微波功率为250 W、时间为30s的固定预处理条件下，通过对料液比、超声功率、超声温度、超声时间4个因素进行单因素试验和正交试验，优化提取工艺条件，并研究经本工艺条件提取的LNT的抗氧化活性，以期为LNT的新型提取工艺研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇：品种为黑面菇，产于浙江省，市售。所使用试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

JA12002电子天平，上海精密科学仪器有限公司；GBSY-4电热恒温水浴锅，北京医疗设备厂有限责任公司；TGL-16B台式高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-52多用途旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TU-1900紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DHG9070电热鼓风干燥箱，济宁市精宏仪器有限公司；FS30C 搅拌粉碎机，广州雷迈机械设备有限公司；KQ-250DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；WD7007L23-K5微波炉，广东格兰仕电器销售有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程 香菇洗净烘干→粉碎→水溶→微波预处理→超声波处理→过滤→上清液蒸发浓缩→乙醇沉淀→离心→在沉淀中加木瓜蛋白酶→离心→上清液二次醇沉→静置过夜→无水乙醇洗涤→稀释粗多糖提取液→测定。

1.3.2 操作要点 将香菇洗净，置于电热鼓风干燥箱中，于80 ℃烘干至恒质量，用搅拌粉碎机粉碎，过40目筛。将制成的香菇粉置于棕色瓶内密封保存备用。称取1.0 g香菇粉置于锥形瓶中，加入蒸馏水溶解。用微波(功率为250 W)预处理30 s后，在超声波清洗器中按照既定条件进行超声波处理，处理后将溶液于4 000 r/min离心10 min，将上清液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积后，加入3倍体积的无水乙醇，在 4 ℃ 条件下静置过夜。将提取液于4 000 r/min离心 20 min。加入蒸馏水溶解沉淀，加入1%～2%木瓜蛋白酶，以稀HCl调节pH值为8.0，于55 ℃水浴中放置2 h。除蛋白后于 4 000 r/min 离心20 min；在上清液中加入4倍体积的无水乙醇沉淀，于4 ℃静置过夜。于4 000 r/min离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤，即得LNT。稀释粗多糖提取液，测定多糖提取率。

1.3.3 LNT提取率的测定 多糖提取率的测定采用改进的苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖作为标准品，精确配制浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。依次量取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL标准溶液，用蒸馏水定容至1.0 mL。加入0.5 mL 6%苯酚、2.5 mL浓H2SO4，摇匀，沸水浴20min，室温放置20 min，于490 nm处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标、D490 nm为纵坐标绘制标准曲线。

根据葡萄糖标准曲线制作方法测定吸光度，根据式(1)计算多糖提取率：

(1)

式中：C为根据标准曲线求得的多糖浓度，g/mL；V为样品溶液的定容体积，mL；D为LNT的稀释倍数；m为香菇原料质量，g。

1.3.4 单因素试验设计 影响LNT提取率的因素较多，如料液比、提取温度和时间、提取次数、pH值等。以微波法作为样品的预处理方法，单因素试验设计如下：

(1)料液比。取在不同料液比下经微波预处理后的香菇溶液，在超声波提取功率为60 W、超声波提取温度为40 ℃、超声波提取时间为15 min的条件下，考察不同料液比(1 g ∶10 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL)对LNT提取率的影响。

(2)超声波提取温度。将料液比设为1 g ∶30 mL，在微波预处理后的香菇溶液超声波提取功率为60 W、超声波提取时间为15 min的条件下，研究不同超声波提取温度(30、40、50、60、70 ℃)对LNT提取率的影响。

(3)超声波提取时间。将料液比设为1 g ∶30 mL，在微波预处理后的香菇溶液超声波提取功率为60 W、超声波提取温度为40 ℃的条件下，考察不同超声波提取时间(10、15、20、25、30 min)对LNT提取率的影响。

(4)超声波提取功率。将料液比设为1 g ∶30 mL，在微波预处理后的香菇溶液超声波提取温度为40 ℃、超声波提取时间为15 min的条件下，考察不同超声波提取功率(60、70、80、90、100 W)对LNT提取率的影响。

1.3.5 正交试验设计 根据单因素试验的结果，选取料液比、超声时间、超声温度、超声功率4个因素的各3个适宜水平，按照L9(34)进行正交试验，优化提取工艺，确定最佳提取工艺条件，因素水平设计见表1。

1.3.6 LNT的抗氧化活性分析

1.3.6.1 总抗氧化能力的测定 采用铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)法测定总抗氧化能力[11-12]。取1 mL不同质量浓度的LNT水溶液进行试验，空白组用去离子水代替，对照组用同等质量浓度的维生素C代替，每个样品重复测定3次。以1.0 mmol/L FeSO4溶液为标准物绘制标准曲线，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4浓度(μmol/L)表示，即为FRAP值。

表1 4因素3水平正交试验因素水平

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的测定 参考李亚辉等的方法测定DPPH自由基清除能力[12-13]。取1 mL不同质量浓度的LNT水溶液，在517 nm波长处测吸光度，空白组用水代替样品，对照组用同等质量浓度的维生素C代替，每个样品重复测定3次。相关公式如下：

(2)

式中：D1为样品组的吸光度；D0为对照组的吸光度。

1.3.6.3 羟自由基清除能力的测定 采用2-脱氧核糖法测定羟自由基清除能力[12，14]。取500 μL不同质量浓度的LNT水溶液进行试验，在510 nm波长处测吸光度，空白组用水代替样品，对照组用同等质量浓度的维生素C代替，每个样品重复3次。相关公式如下：

(3)

式中：D1为样品组的吸光度；D0为空白组的吸光度。

1.3.7 数据分析 试验结果以平均值±标准偏差表示。采用Excel 2007和SPSS 19.0分析软件进行方差分析和t检验。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖溶液标准曲线

以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，绘制葡萄糖标准曲线。回归方程为y= 6.536x+0.04，r2=0.99(图1)。式中：y为吸光度；x为质量浓度(mg/mL)。由图1可见，该法的标准曲线在0.01～0.1 mg/mL范围内能很好地符合线性要求，可以用来进行LNT含量测定。

2.2 单因素研究

2.2.1 料液比对LNT提取率的影响 由图2可知，在料液比为1 g ∶10 mL～1 g ∶30mL的范围内，LNT提取率随着料液比提高而显著增加。在料液比为1 g ∶30 mL～1 g ∶50 mL的范围内，随着料液比的提高，提取率反而降低。在LNT提取过程中，水起到超声波介质的作用。溶剂用量较少时，原料细胞组织浸润不完全，使得提取效果较差。随着料液比的提高，溶剂量增大，从而使超声波的介质增多，降低了多糖物质向外扩散的阻力，进而使LNT提取率不断提高[15]。然而，过多的溶剂会消耗大量超声波辐射能量，进而影响多糖的析出[9]。当料液比为1 g ∶30 mL时，多糖提取率最高，为5.35%。因此可见，在单因素条件下，1 g ∶30 mL为最佳料液比。

2.2.2 超声波提取温度对LNT提取率的影响 由图3可知，香菇多糖的提取率首先随着超声提取温度的增加而提高，当提取温度为60 ℃时，多糖提取率最高，可达5.68%；当提取温度为70 ℃时，多糖提取率显著降低。温度过高可能使多糖溶液黏度增加，且使部分多糖结构遭到破坏，从而使其提取率降低。因此可见，在单因素条件下，60 ℃为最佳超声提取温度。

2.2.3 超声波提取时间对LNT提取率的影响 由图4可知，当超声波提取时间为10～20 min时，随着提取时间的延长，LNT提取率显著提高；当超声时间为20 min时，多糖提取率最高，为5.73%；当提取时间超过20 min后，多糖提取率开始下降。这说明多糖提取过程与超声波处理时间密切相关，超声波处理时间短，多糖溶出得不充分；超声处理时间过长，产生较强的机械剪切作用，使组织中的大量细胞进一步破裂，从而使细胞内大量不溶物及黏性物质等混入提取液中，溶液中杂质增多，黏度增大，从而增大了传质阻力，影响了多糖成分的溶出。另一方面，可能是随着超声提取时间的延长，超声波较强的空化和机械振动使部分多糖大分子链断裂，其小分子的糖在醇沉处理过程中损失了，从而降低了多糖的提取率[16]。因此可见，在单因素条件下，20min为最佳超声提取时间。

2.2.4 超声波提取功率对LNT提取率的影响 由图5可知，在60～70 W的超声功率范围内，随着超声功率的增加，LNT的提取率也在提高，当超声功率为70 W时，多糖提取率最高，为6.25%。原因可能是随着超声功率的增加，超声空化效应、高速射流以及机械剪切的搅拌作用等加强，有效地减少了水与粉末间的阻滞，使细胞得到更加充分的破裂，从而加速了细胞中多糖分子在水中的溶出。当功率超过70 W时，LNT的提取率开始下降。这可能是由于大功率的物理剪切作用及其引起的局部溶液瞬时升温过热，造成部分多糖分子链的断裂而降解，使多糖糖苷键被打断，多糖结构被破坏，在后处理中造成了损失，从而使多糖提取率降低[17]。因此可见，在单因素条件下，超声波提取功率应以70 W为宜。

2.3 LNT微波预处理超声波提取法最佳条件的确定

2.3.1 正交试验结果 由表2可以看出，RD>RB>RC>RA，可知超声波功率的变化对多糖提取率的影响最明显，进一步说明超声波在该提取方法中的重要作用。其他对多糖提取率影响较大的因素依次为超声时间、超声温度、料液比。由k值得到最优水平为A3B2C2D3。

表2 正交试验结果

2.3.2 LNT提取率方差分析 为了进一步确定微波预处理超声波法提取LNT的最佳工艺条件，对试验误差试验条件对试验结果的影响进行评估和判断，用SPSS 19.0软件进行方差分析。由表3可知，料液比、超声时间、超声温度以及超声功率都会影响多糖的提取率，其中超声时间、超声温度以及超声功率3个因素的影响均达到显著水平(P<0.05)。由于料液比对于提取率的影响并不显著，对试验结果和数据的影响不大，本着高效节约的原则，确定A2为A因素的最佳水平。综合以上分析，确定最佳工艺条件组合为A2B2C2D3，即料液比为1 g ∶20 mL、超声波处理时间为20 min、超声温度为 60 ℃、超声功率为80 W。

表3 方差分析结果

注：“*”表示差异显著(P<0.05)。

2.3.3 验证试验 对通过正交试验得出的最佳工艺条件进行最优化验证试验，结果表明，3次平行试验的平均提取率为7.16%，明显高于其他条件下的LNT提取率。

2.4 LNT的体外抗氧化性分析

2.4.1 LNT的总抗氧化能力 由图6可知，LNT的总抗氧化能力随着其质量浓度的增加而逐渐增强，当LNT质量浓度为 25 mg/mL 时，其总抗氧化能力约达到95.39 μmol/L，说明所提取的LNT具有一定的总抗氧化能力。但与相同质量浓度的维生素C相比，LNT的FRAP值较小，说明LNT的总抗氧化能力略低。

2.4.2 LNT对DPPH自由基的清除能力 由图7可知，当LNT质量浓度为0～25 mg/mL时，LNT对DPPH自由基的清除率随着样品质量浓度的升高而提高。当质量浓度为 25 mg/mL 时，其DPPH自由基清除率达到76.22%。与相同质量浓度的维生素C标准品相比，LNT对DPPH自由基的清除率略大，说明LNT具有较强的DPPH自由基清除能力。

2.4.3 LNT对羟自由基的清除能力 由图8可知，当LNT质量浓度为0～15 mg/mL时，其对羟自由基的清除能力增加得较快；当LNT质量浓度为15～25 mg/mL时，其对羟自由基的清除能力增加得较慢；当LNT质量浓度为25 mg/mL时，对羟自由基的清除率达最大值，为92.41%。LNT对羟自由基的清除效果略高于同质量浓度的维生素C，说明所提取的LNT具有较强的羟自由基清除能力。

3 结论

本研究工艺采用微波预处理-超声波辅助法提取香菇多糖，得到其最优化工艺条件：微波功率为250 W，预处理时间为30 s，料液比为1 g ∶20 mL，超声功率为80 W，温度为 60 ℃，超声时间为20 min。在此优化条件下，LNT提取率为7.16%，明显高于目前常见新技术的提取率，如超声波辅助提取法(6.47%)[18]、微波辅助提取法(6.49%)[19]、超声波与酶协同提取法(6.94%)[15]。本工艺过程使用的微波与超声波功率较低，无加热等其他工艺，极大地降低了能源消耗，且提取的LNT具有良好的体外抗氧化活性。由此可见，LNT的微波预处理-超声波辅助提取工艺既对节能环保提供了很好的思路，也可为LNT的工业化生产提供理论依据。