张 谦， 刘一尘， 徐 进， 李建正， 刘应鹏， 卜昌超， 雷连成

(1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062； 2.河南后羿实业集团有限公司，河南郑州 625014； 3.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023)

肉鸡大肠杆菌病是致病性大肠埃希氏菌引起的一种急性或慢性细菌性传染病[1]，是重要的食源性人畜共患病原菌[2]。大肠杆菌血清型多，各血清型间交叉保护力低，疫苗免疫效果差，临床上主要是依靠抗菌药物进行预防和治疗，但抗菌药物的滥用导致多重耐药、交叉耐药、耐药谱广的大肠杆菌菌株不断出现，大肠杆菌病普遍多发，给全球养禽业造成了巨大的经济损失[3-4]。中草药除具有无耐药性、无残留、能增强机体免疫机能等优点，还具有消除耐药质粒[5-8]、抑制细菌被膜形成[9-11]的特点，因而成为畜禽疾病防治的研究热点[12]。但中草药作为天然药物，存在药效不理想、有效成分含量低、结构过于复杂等问题，限制了中草药在畜禽养殖业中的应用。利用现代中草药发酵技术[13]，可以提高中草药活性成分含量，改变或产生一些中草药中不具有的活性成分，将中药的大分子物质，经过微生物转化成为能够被机体直接吸收的小分子成分，快速达到稳态血药浓度，提高机体抗病能力。本研究采用加味白头翁散及其发酵产物对野毒分离株大肠杆菌DE感染肉仔鸡进行防治试验，并检测加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡肠道菌群的影响，为加味白头翁散发酵产物防治鸡大肠杆菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

加味白头翁散由白头翁60 g、黄连30 g、黄柏45 g、秦皮60 g及黄芪45 g组成，加味白头翁散发酵产物采用3%枯草芽孢杆菌固态发酵获得，均由河南后羿实业集团有限公司提供。临床用法、用量：混饲，2%预防剂量，4%治疗剂量。野毒分离株大肠杆菌DE，由河南科技大学预防兽医学实验室提供；伊红美兰(eosin-methyleneblue，简称EMB)培养基、Pfizer琼脂培养基、MRS培养基、BLB培养基及普通琼脂培养基，均购自山东青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 试验动物

2017年4月河南洛阳伊川某肉鸡场提供1日龄AA白羽肉仔鸡，于河南科技大学实验牧场隔离饲养至5日龄后进行分组试验。

1.3 试验方法

1.3.1 肉仔鸡大肠杆菌感染模型建立 将野毒分离株大肠杆菌DE在普通琼脂平板上活化后，挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min条件下培养18～24 h，对细菌培养物用LB液体培养基10倍稀释，使菌悬液浓度分别为 1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL。

10日龄AA白羽肉鸡50羽，随机分为A、B、C、D及对照组，A、B、C、D分别胸肌注射不同浓度梯度的菌悬液，对照组注射生理盐水，注射量均为0.5 mL/羽。观察并记录72 h内试验鸡发病症状、死亡数量。及时剖检死亡鸡只，采集肝脏、心包分泌物，分离鉴定致病菌株为攻毒菌株。根据试验结果计算半数致死量(LD50)并作为肉仔鸡攻毒保护试验的细菌浓度。采用Reed-muench累计法计算LD50，公式为lgLD50=高于50%死亡率的稀释度的对数+距离比例值×稀释倍数的对数；距离比例值 =(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)。

1.3.2 肉仔鸡大肠杆菌攻毒防治试验 选取180羽健康且体质量相近的5日龄健康白羽肉仔鸡，随机分为6组，每组3个重复，每个重复10羽，即Ⅰ组为加味白头翁散发酵产物预防组，Ⅱ组为加味白头翁散预防组，Ⅲ组为感染对照组，Ⅳ组为健康对照组，Ⅴ组为加味白头翁散发酵产物治疗组，Ⅵ组为加味白头翁散治疗组。

Ⅰ、Ⅱ组于攻毒前5 d连续饲喂含2%加味白头翁散发酵产物、2%加味白头翁散的基础日粮；肉仔鸡10日龄时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组胸肌注射0.5 mL大肠杆菌菌液，浓度为“1.3.1”节中半数致死量浓度，Ⅳ组肉鸡胸肌注射0.5 mL生理盐水，然后，Ⅰ、Ⅴ组和Ⅱ、Ⅵ组分别继续饲喂含4%加味白头翁散发酵产物、4%加味白头翁散的基础日粮。在用药防治试验期间，观察记录各组肉仔鸡发病、死亡等各项数据，计算试验鸡的发病率、死亡率、痊愈率及保护率。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0软件对肉仔鸡发病率、死亡率、痊愈率、保护率以及肠道菌群、抗氧化指标进行显著性分析，结果以“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 肉仔鸡大肠杆菌感染模型建立

分别将浓度为1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的野毒分离株大肠杆菌DE悬液进行攻毒试验2 h后，试验鸡开始出现精神萎靡、采食减少或废绝、畏寒扎堆，发病率可达90%以上；攻毒8 h后，试验鸡出现不同程度死亡。剖检死亡鸡只，出现心包炎、肝周炎及盲肠、十二指肠出血等典型的大肠杆菌病病变。分离鉴定致病菌株，均呈现野毒分离株大肠杆菌DE典型的染色特性及培养特性，可确定致病菌为野毒分离株大肠杆菌DE。

采用Reed-muench累计法计算野毒分离株大肠杆菌DE对试验鸡的半数致死量为LD50=106.33CFU/mL(表1)。最终确定野毒分离株大肠杆菌DE发病模型：细菌浓度为106.33CFU/mL，0.5 mL/羽，感染途径为胸肌注射。

表1 野毒分离株大肠杆菌DE LD50测定

2.2 肉仔鸡大肠杆菌攻毒防治试验

野毒分离株大肠杆菌DE以半数致死剂量感染肉仔鸡，进行攻毒保护试验，2 h后，预防Ⅰ、Ⅱ组肉仔鸡仅个别鸡出现畏寒怕冷、精神不振等症状，未出现死亡情况，至试验结束时，精神、饮食状况恢复正常。感染Ⅲ组至8 h开始出现死亡，24～48 h出现死亡高峰，整个试验过程中大部分鸡出现精神不振、食欲减少等症状。空白对照组鸡精神、食欲、饮水正常，无鸡死亡现象。治疗Ⅴ、Ⅵ组12 h开始出现死亡，24～48 h 出现死亡高峰。

结果(表2)表明，预防Ⅰ组肉仔鸡与感染对照Ⅲ组、治疗Ⅴ组、Ⅵ组相比死亡率率明显下降，保护率极显著上升(P<0.01)，表明加味白头翁散发酵产物对人工感染野毒分离株大肠杆菌DE的肉仔鸡有较强的预防作用；预防Ⅱ组肉仔鸡感染与对照Ⅲ组、治疗Ⅴ组、Ⅵ组相比死亡率明显下降，保护率极显著上升(P<0.01)，表明加味白头翁散对人工感染野毒分离株大肠杆菌DE的肉仔鸡也具有较强的预防作用，但效果不如加味白头翁散发酵产物。感染对照Ⅲ组、治疗Ⅴ组、Ⅵ组的保护率差异不显著。

表2 加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡人工感染

注：同列数据后不同小写字母、大写字母分别表示差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)。表3同。

2.3加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡肠道菌群的影响

将大肠杆菌、肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌、芽孢杆菌等的菌群数量采用SPSS 20.0进行显著性分析，结果见表3。

由表3可见，预防Ⅰ组、Ⅱ组以及治疗Ⅴ组、Ⅵ组肉仔鸡盲肠中大肠杆菌的数量极显著低于感染对照组(P<0.01)，均与健康对照组差异不显著(P>0.05)；肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌及芽孢杆菌等的菌群数量均极显著高于感染对照组(P<0.01)，预防组肠球菌、双歧杆菌数量与健康对照组差异不显著(P>0.05)，芽孢杆菌、乳酸菌数量与健康对照组差异极显著(P<0.01)。预防Ⅰ组、Ⅱ组及治疗Ⅴ组、Ⅵ组肉仔鸡盲肠中大肠杆菌的菌群数量差异不显著(P>0.05)；预防Ⅰ组、Ⅱ组肉仔鸡盲肠中肠球菌、芽孢杆菌、双歧杆菌的菌群数量略高于治疗Ⅴ组、Ⅵ组，差异极显著(P<0.01)；预防Ⅰ组肉仔鸡盲肠中芽孢杆菌、乳酸菌的菌群数量略高于预防Ⅱ组，差异显著(P<0.05)。

表3 加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡肠道菌群的影响

3 讨论与结论

在抗生素选择性压力下，大肠杆菌耐药菌株呈交叉耐药和多重耐药趋势，而95%耐药基因位于质粒、转座子、整合子及噬菌体等可转移遗传元件上，从而造成细菌耐药性的广泛传播。尤其是大肠杆菌耐药性质粒，不仅可在同种、不同种微生物细胞间传递，而且可作为动物和人类抗生素耐药基因库，使耐药基因通过食物链在动物抗生素耐药共生菌和人体携带菌之间转移。近年来研究表明，具抑菌作用的中草药对大肠杆菌耐药质粒有消除作用，如苍术[5]、黄芩[6]、黄连[7]、地锦草[8]等。

大肠杆菌耐药性还与大肠杆菌侵入机体器官或部位形成生物被膜有关联。形成生物被膜的大肠杆菌进入一种饥饿的非生长状态[14]，对抗生素几乎完全不敏感；大肠杆菌的三维生物被膜结构可有效阻碍抗生素的穿透，在通常情况下，只有少量抗生素渗透到生物被膜内，其浓度并不足以有效杀灭深部细菌；大肠杆菌形成生物被膜后可随着环境的变化具有特有的抗生素逃避机制。姚禹等研究表明，单味中药、复方中药或中药单体对大肠杆菌生物被膜的形成具有很好的抑制作用[9-11]。

中草药对肠道有益菌具有促生长作用，为益生菌的生长繁殖提供营养条件，增加肠道益生菌(如双歧杆菌、乳酸菌、粪链球菌等)的种类和数量，抑制有害菌的生长和增殖，甚至还能抑制或杀灭有害菌，对动物机体健康发挥着关键作用[15]。而中草药发酵是微生物在温和条件下新陈代谢过程中产生纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶系，降解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶等成分，促进活性成分的释放，催化其他营养物质进行氧化、酯化、甲基化和还原化等生物反应，最大限度地提取中草药活性成分或转化原成分，分解毒性物质，可促进药物有效成分被吸收，以提高机体抗病能力[16-17]。

本研究结果表明，加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡感染野毒分离株大肠杆菌DE的保护作用比加味白头翁散强；加味白头翁散及加味白头翁散发酵产物对肉仔鸡感染野毒分离株大肠杆菌DE的预防效果比治疗效果好。加味白头翁散及加味白头翁散发酵产物处理的肉仔鸡盲肠中大肠杆菌的菌群数量极显著低于感染对照组(P<0.01)，肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌及芽孢杆菌的菌群数量均极显著高于感染对照组(P<0.01)。饲喂加味白头翁散发酵产物肉仔鸡盲肠中大肠杆菌的菌群数量略低于饲喂加味白头翁散，肠球菌、乳酸菌、双歧杆菌及芽孢杆菌的菌群数量略高于饲喂加味白头翁散，肠球菌、双歧杆菌的菌群数量差异不显著(P>0.05)，乳酸菌、芽孢杆菌的处理间差异显著(P<0.05)。因此，加味白头翁散发酵产物能有效预防肉仔鸡大肠杆菌病，对恢复肠道微生态平衡、保持动物机体健康状况具有重要作用，这也为加味白头翁散发酵产物进一步临床应用奠定了基础。