杜方原，冯春燕，仇松寅，王彩霞，张永宁，林祥梅，吴绍强

(中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 大兴 100176)

非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)是具有二十面体结构的DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，能引起猪的急性、热性、高度接触性传染疾病[1]。疣猪等野生哺乳动物在感染ASFV后并不一定会发病，为发现及预防ASFV增加了更大的难度[2]。目前ASFV并没有有效的疫苗进行防控，因此，建立快速准确的诊断方法是防控该病的重要手段。

ASFV基因组全长约170 kb，含有150多个开放阅读框。K205R蛋白由未分配的开放阅读框编码[3]，Reis等人的研究表明，K205R蛋白诱导猪只能产生较强的免疫反应，是ASFV主要的抗原之一[4]。K205R主要在动物的感染初期表达，这对ASFV的早期诊断具有重大意义[5]。为此，本研究利用大肠杆菌原核表达系统表达ASFV K205R蛋白，在其基础上制备多抗，以期为建立该病的血清学检测方法提供生物材料。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌BL21细胞，pET-21a载体，pMD18-T载体、限制性内切酶BamHI、XhoI，T4 DNA连接酶，购自宝生物工程(大连)有限公司； 普通TaqDNA聚合酶，购自北京全式金生物技术有限公司。

IPTG、蛋白质Marker和 Western Blot 发光液等，购自北京全式金生物技术有限公司；镍离子金属螯合(Ni-NTA)预装柱，购自QIAGEN公司；辣根酶标记猪IgG二抗，购自Abcam公司；辣根酶标记兔IgG 二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；引物合成及测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 K205R基因的扩增和质粒构建 参考ASFV的BA71V毒株(GeneID:22220430)的K205R基因序列,合成K205R基因，该基因编码框全长615 bp，其编码蛋白全长205个氨基酸，分子量约为23.7 kDa。……