张 萍, 万 萍, 张忠东, 朱燕忠, 许黎霞, 周 琳

(1. 江苏省太湖疗养院，江苏 无锡，214086;2. 南京医科大学附属无锡市精神卫生中心 药学部，江苏 无锡，214000)

亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢中的一个关键酶[1-2]。MTHFR基因具有多态性，若其基因677位C→T或(和)1298位A→C突变，则会明显降低MTHFR的活性，从而直接影响Hcy在体内的代谢，引发高同型半胱氨酸血症(HHcy)[3-4]。相关研究[5]表明, MTHFR基因突变与其他疾病具有相关性。本研究探讨MTHFR基因突变与HHcy合并代谢综合征(MS)以及高脂血症(HL)合并MS的关系，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取本院2017年1—12月收治的MS患者98例作为观察组, MS诊断标准参照2005国际糖尿病联盟(IDF)标准，其中男83例，女15例; 年龄30～66岁，平均(51.67±9.44)岁。另选择同期在本院进行健康体检志愿者49例作为对照组，其中男24例，女25例; 年龄27～64岁，平均(47.06±7.40)岁。2组受试者性别、年龄等基本资料比较无显著差异(P>0.05), 具有可比性。

1.2 分组方法

根据是否合并HHcy, 将观察组患者进一步分为MS合并HHcy组、MS未合并HHcy组。MS合并HHcy组55例，其中男47例，女8例; 年龄39～65岁，平均(50.33±9.08)岁。MS未合并HHcy组43例，其中男36例，女7例; 年龄40～68岁，平均(52.14±9.47)岁。2组患者性别、年龄等基本资料比较无显著差异(P>0.05), 具有可比性。HHcy诊断标准为血液中Hcy的浓度高于15 μmol/L。

根据是否合并HL, 观察组患者又可分为MS合并HL组、MS未合并HL组。MS合并HL组41例，其中男35例，女6例; 年龄39～67岁，平均(50.49±9.12)岁。MS未合并HL组57例，其中男48例，女9例; 年龄39～68岁，平均(51.77±9.38)岁。2组患者在性别、年龄等基本资料方面比较无显著差异(P>0.05), 具有可比性。HL诊断标准为空腹血清总胆固醇>5.17 mmol/L, 甘油三酯>1.71 mmol/L。

1.3 PCR-RFLP技术检测C667T与A1298C基因多态性

1.3.1 基因组DNA抽提: 总 DNA抽提试剂盒为AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒。严格按照试剂盒说明书的操作流程进行基因组DNA抽提。

1.3.2 基因分型: PCR扩增SNP位点所在片段: ① 在1.5 mL离心管中分别加入200 μL PCR-buffer (10×), 60 μL Mg2+(100 mmol/L), 200 μL dNTP (20 mmol/L), 20 μL Taq酶(5 U/μL), 400 μL Q-solution (4×), 40 μL primer (5 pmol/L), 最后加入980 μL去离子水。充分混匀后离心，再取19 μL分装在200 μL的PCR反应管中，最后再加入1 μL基因组DNA。② 在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序: 95 ℃变性120 s, 40个循环，每个循环有3个温度, 94 ℃下30 s, 56 ℃下90 s, 65 ℃下30 s, 最后65 ℃延伸600 s。③ 反应结束后，取2 μL反应产物在3.0%琼脂糖胶、0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功。

PCR产物的连接酶检测反应: ① 在PCR扩增产物中加入等体积双蒸水(ddH2O)稀释，作为连接反应的模板。② 在1.5 mL离心管中分别加入100 μL buffer (10×), 100 μL Probe Mix, 5 μL连接酶, 695 μL去离子水。充分混匀后离心，再取9 μL分装在200 μL的PCR反应管中，最后再加入1 μL PCR反应产物。③ 在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序: 95 ℃变性120 s, 35个循环，每个循环有2个温度, 94 ℃下30 s, 50 ℃下120 s。将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应。④ 各取1 μL LDR连接产物与0.6 μL ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准和10 μL hidi上样液混合, 95 ℃加热变性2 min, 冰中骤冷，上3730毛细管电泳，应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

1.4 观察指标

比较MS合并HHcy组与MS未合并HHcy组, MS合并HL组与MS未合并HL组，以及观察组与对照组C667T与A1298C位点基因型情况，判断基因与MS合并HHcy的相关性，基因与MS合并HL的相关性，以及基因与MS的相关性。

1.5 统计学处理

采用SHEsis软件计算各组基因型频率及其等位基因频率，计算Hardy-Weinberg遗传平衡检验，计算比值比(OR值)和95%可信区间(CI),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检测比较

MTHFR C667T与A1298C突变位点基因型和等位基因频率分布经过Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,P值均大于0.5, 表明MTHFR基因型分布在各组人群中均符合遗传平衡。

2.2 MS合并HHcy组与MS未合并HHcy组患者基因频率分布位点情况

MS合并HHcy组与MS未合并HHcy组患者A1298C位点的基因型无显著差异(P>0.05), 而C667T位点的基因型存在显著差异(OR=2.3,P<0.05), 提示在MS患者中, MTHFR C667T基因突变可能是诱发HHcy的高危因素。见表1。

2.3 MS合并HL组与MS未合并HL组患者基因频率分布位点比较

MS合并HL组与MS未合并HL组患者C667T与A1298C两个位点基因型无显著差异(P>0.05), 提示在MS患者中, HL的发病与MTHFR基因的多态性并无显著相关性。见表2。

表1 MS合并HHcy组与MS未合并HHcy组患者基因频率分布比较[n(%)]

表2 MS合并HL组与MS未合并HL组患者基因频率分布比较[n(%)]

2.4 观察组与对照组基因频率分布位点比较

观察组与对照组患者C667T与A1298C两个位点的基因型无显著差异(P>0.05), 提示MS的发病与MTHFR基因的多态性并无显著相关性。见表3。

表3 观察组与健康对照组基因频率分布比较[n(%)]

3 讨 论

人类的MTHFR基因由11个外显子与10个内含子构成。MTHFR基因共有20多个突变位点，而其中以C667T与A1298C两个突变位点最为常见。C667T与A1298C突变位点具有明显的分布差异[6]。C667T基因位于MTHFR基因的第4个外显子，由于胞嘧啶(C)突变成了胸腺嘧啶(T), 从而导致丙氨酸变换成缬氨酸，因此酶的活性降低。A1298C基因位于MTHFR基因的第7个外显子，由于胞嘧啶(C)突变成了腺嘌呤(A), 因此谷氨酸变换成丙氨酸。该突变虽然不会影响酶的耐热性，但是却显著降低了酶的活性，且主要影响酶的调节。C667T与A1298C突变对于酶活性的降低具有协同作用[7]。

在人体中，有3个关键酶参与到Hcy的代谢中，分别为MTHFR、蛋氨酸合成酶、胱硫醚-β-合成酶。MTHFR在Hcy的代谢过程中扮演着重要的角色[8]。当MTHFR基因出现突变而降低其酶的活性，则会引起血浆Hcy水平的显著增高[9]。多项研究[10-11]表明, MTHFR C667T和(或)A1298C基因发生突变，可使患者血液中Hcy水平显著增加，出现HHcy的症状。本研究中, MS合并HHcy组与MS未合并HHcy组患者MTHFR C667T基因突变与HHcy的发生具有显著相关性(P<0.05), 表明HHcy的发病与MTHFR C667T基因突变具有密切相关性。

本研究结果发现，在C667T多态性的基因型中, CC基因型携带者Hcy水平低于CT基因型携带者，提示CC基因可能是HHcy的保护因素。相关文献[12]表明，在A1298C多态性基因型中, AC基因型携带者Hcy水平显著低于AA基因携带者, AC基因可能是HHcy的保护因素，与本研究的结果不一致，考虑原因一方面是A1298C基因型存在一定的地域差异; 另一方面是本研究样本量较少，需要进行更大样本群体的研究。

相关研究表明, MTHFR基因发生突变后，导致MTHFR酶活性的降低，进一步影响了DNA、RNA的合成以及DNA的甲基化，导致患者血液中的Hcy浓度提高，形成N-同型半胱氨酸酸化低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C), 最终引发HL。本研究中, MS合并HL组与MS未合并HL组患者MTHFR C667T与A1298C基因突变与HL无显著相关性(P>0.05)。本研究还进一步比较了观察组与对照组中MTHFR C667T与A1298C基因突变的情况，结果发现，观察组与对照组MTHFR C667T与A1298C基因型无显著差异(P>0.05)。对于上述2个阴性结果，可能的原因是由于本次实验入组的患者较少，所得结果可能存在一定的偏倚，并不能够正确反映临床的实际情况，因此MS以及HL的发生与MTHFR C667T与A1298C基因突变是否存在相关性，还需要进行进一步深入研究。