白羽祥，杨焕文，徐照丽，吴 涛，易建华，王 戈，*

(1．云南农业大学烟草学院，云南昆明650201;2．云南省烟草农业科学研究院，云南昆明650021;3．云南中烟工业有限责任公司，云南昆明650224;4．广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530001)

长期连作会带来忌连作作物生长发育进程受阻、病害和虫害发生严重、产质量下降等一系列问题［1－2］。烤烟是典型的忌连作作物，长期连作会严重影响烟叶生长发育及产质量形成［3］。虽然业界一直提倡轮作，但由于耕地面积逐年减少，加上利益驱使，我国烤烟连作现象依然普遍，严重制约了烟草行业的可持续发展［4］。

已有研究表明，连作导致土壤质量趋劣［5］。随着连作年限增加，土壤养分失衡［6－7］，酶活性变化［8－10］，微生物数量及多样性降低［11］，自毒物质积累［12］，多因素相互作用对土壤环境产生不利影响，进而导致植株生长发育受抑。近年来，土壤中有毒物质积累在连作中的作用机理倍受重视，其中，酚酸类物质在土壤中的积累被认为是导致连作障碍的重要因素之一［13－14］。酚酸物质广泛分布于土壤中，具有十分重要的生理和生态功能［15－18］。对水稻、大豆、花生、黄瓜、中药材，以及林木等的研究发现，连作土壤中酚酸物质的含量数倍于轮作，且随连作年限增加呈明显积累过程［19－21］。相对其他作物，连作植烟土壤中酚酸物质的动态变化研究较少。柯文辉［22］研究发现，在烟草根际土壤水浸提液中存在着化感自毒物质，这种物质随着种植茬次的延长有富集效应，但未明确浸提液中哪种物质起到了化感作用。符建国等［23］研究发现，连作与轮作植烟土壤根际土壤酸性有机组分种类、数量、化学成分存在差异，且连作植烟土壤中酸性物质含量较高。但陈冬梅等［24－25］发现，虽然土壤浸提液中存在自毒物质，但烟草连作后根际土壤酸类物质种类却显著减少。因此，有必要进一步明确连作植烟土壤中酚酸类物质种类、含量的变化趋势，以及酚酸类物质在植烟土壤中的可能作用机制。

土壤各因子的相互作用，共同影响土壤质量［26］，进入土壤的酚酸类物质也必将参与土壤中的各种物质和能量代谢。酚酸类物质如何影响土壤环境中的其他因子，其相互作用关系如何等尚待探究，这对丰富酚酸类物质在连作问题中的作用机理认知具有积极意义［27－29］。由于酚酸类物质与土壤酶活性和理化性状之间可能具有复杂的关系，双变量相关性分析未必能反映两个变量间的真实关系，因此，本研究在相关性分析的基础上，利用SPSS 19.0软件中的逐步回归模型进行分析，研究了不同连作年限下植烟土壤中酚酸类物质与土壤理化性状、酶活性的关系，以便筛选出真正具有影响的变量，即影响因素［30］，旨在为探明酚酸类物质在连作问题中的作用机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1．1 连作植烟土壤样品采集

于2017年在云南省保山市施甸县姚关镇陡坡村连片烤烟种植示范区采集土样，该区域土地由同一农户承包，土壤质地为砂壤土，种植烤烟品种为K326，前茬作物为大麦。每年烤烟施氮量(N)为 120 kg·hm－2，施磷量(P2O5)为 90 kg·hm－2，施钾量(K2O)为321 kg·hm－2，肥料由当地烟草公司提供。栽培管理措施统一按照当地优质烟叶生产技术进行。

每年植烟之前，利用五点取样法采取第1年(T1，对照)、第6年(T6)、第 8年(T8)、第 14年(T14)和第16年(T16)种植烤烟的0～20 cm土样，每一处理采取2 kg。

1．2 土壤样品处理及方法

各处理称取100.00 g新鲜样品置于离心管中(3 次重复)，加入100 mL 1 mol·L－1NaOH 放置24 h，振荡60 min，离心后将滤液用12 mol·L－1的 HCl酸化至pH 2.5，120 min后离心除去胡敏酸，然后将上清液过0.22 μm的纤维膜，滤液用高效液相色谱(HPLC)测定，结果按照烘干土质量换算。

1．3 测定项目和测定方法

土壤理化性状测定项目包括pH、有机质、全N、全P、全K、碱解N、有效P、速效K，分别参照行业标准 NY/T 1377—2007、NY/T 1121.6—2006、NY/T 53—1987、NY/T 88—1988、NY/T 87—1988、LY/T 1229—1999、NY/T 1121.7—2006、NY/T 889—2004进行测定。

酶活性依据梅守荣［31］的方法进行测定。土壤过氧化氢酶(CAT)活性采用KMnO4滴定法测定;脲酶活性利用靛酚蓝比色法测定;蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定;酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定。

土壤酚酸类化合物的测定采用HPLC进行。仪器为Aglient 1200高效液相色谱仪，色谱柱为SunFireTMC18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速1 mL·min－1，柱温 25oC，检测波长 280 nm。流动相A(甲醇)和流动相B(pH值2.5的乙酸水溶液)的梯度如下:0 min，流动相A 30%，流动相B 70%;15 min，流动相A 50%，流动相B 50%;16 min，流动相A 70%，流动相B 30%;30 min，流动相A 0，流动相B 100%。标准样品分别为阔马酸、对羟基苯甲酸、间苯三酚、香草酸、香兰素、阿魏酸、邻苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水杨酸，进样量10 μL。每个周期分析结束后，等待10 min，以便去除干扰成分的影响，保证分析结果的稳定性和重复性。

1．4 数据处理

实验数据采用Microsoft Office 2013进行初步处理，采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，利用Duncan's新复极差法进行多重比较，并在相关性分析的基础上利用逐步回归模型对各项数据进行分析。

2 结果与分析

2．1 连作对植烟土壤理化性状的影响

从表1可以看出:随着连作年限增加，植烟土壤pH值、有机质和全氮含量降低，速效钾含量随连作年限延长而表现出升高趋势，连作第14年和第16年的土壤速效钾含量显著(P＜0.05)高于其他处理;全磷、全钾、碱解氮和有效磷含量随连作年限延长呈现出先降低后升高的趋势，最低值分别出现在第6年、第8年、第14年和第14年。以上结果表明，连作导致植烟土壤酸化，各养分发生非均衡变化。

2．2 连作对植烟土壤酶活性的影响

从表2可以看出，随着连作年限延长，植烟土壤中过氧化氢酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈现出先升高后降低的趋势，但不同酶活性的峰值出现在不同年限，其中，第8年的过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性显著(P＜0.05)高于其他年限，第6年的脲酶活性显著(P＜0.05)高于其他年限，第6年和第8年的蔗糖酶活性显著(P＜0.05)高于其他年限。

2．3 连作对植烟土壤酚酸类物质的影响

从表3可以看出，在植烟土壤中检出了8种酚酸类物质，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸。其中，间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸和总量整体表现出随着连作年限延长而升高的趋势，且均以第16年最高，显著(P＜0.05)高于其他处理。苯甲酸和肉桂酸含量则呈先升高后降低趋势。

表1 连作对植烟土壤理化性状的影响Table 1 Effect of continuous cropping on soil physiochemical properties in tobacco-planted soil

表2 连作对植烟土壤酶活性的影响Table 2 Effect of continuous cropping on soil enzymes activities in tobacco-planted soil

表3 不同连作年限植烟土壤酚酸类物质种类和含量Table 3 Species and contents of phenolic acids in tobacco-planted soil mg·kg －1

2．4 酚酸类物质与土壤酶活性、理化性状的相关性分析

从表4可以看出，酚酸类物质含量与土壤酶活性、理化性状具有不同程度的相关性。土壤过氧化氢酶与对羟基苯甲酸呈显著负相关(P＜0.05)，与肉桂酸呈极显著正相关(P＜0.01)。脲酶与间苯三酚、阔马酸、阿魏酸、酚酸总量呈显著负相关(P＜0.05)。土壤pH值与间苯三酚含量呈显著负相关(P＜0.05)。

2．5 酚酸类物质与土壤酶活性、理化性状的相互影响

逐步回归分析得出的偏回归方程的标准化系数代表了对应自变量的影响力，标准化系数的正负分别代表了该自变量对因变量所起到的促进或抑制作用［30］。

由表5可以看出，以酚酸类物质为自变量，土壤酶活性和理化性状为因变量，通过逐步回归分析剔除无关变量后，拟合出pH与间苯三酚、过氧化氢酶与肉桂酸、脲酶与阔马酸的回归方程，说明除间苯三酚影响pH、肉桂酸影响过氧化氢酶、阔马酸影响脲酶外，其余酚酸类物质对土壤其他酶活性和理化性状无显著影响。从标准化系数上来看，间苯三酚对pH有抑制作用，肉桂酸对过氧化氢酶活性有促进作用，阔马酸对脲酶活性有抑制作用。

表4 酚酸类化合物与土壤酶活性、化学性状相关性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic compounds and soil enzymes activities and physiochemical properties

表5 酚酸类物质与土壤酶活性、理化性状的逐步回归分析Table 5 Stepwise regression analysis of phenolic acids and soil enzymes activities and physiochemical properties

由表6可以看出，以酚酸类物质为因变量，以酶活性为自变量，通过逐步回归分析剔除无关变量后，拟合出间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和酚酸类物质总量的回归方程，说明除香草酸、香兰素和苯甲酸外，酶活性对酚酸类物质有一定的影响。从标准化系数上来看，间苯三酚、阔马酸和酚酸类物质总量受脲酶的抑制作用，对羟基苯甲酸和肉桂酸分别受过氧化氢酶的抑制和促进作用，阿魏酸分别受脲酶和过氧化氢酶的抑制作用、蔗糖酶的促进作用，且以脲酶的影响最大、蔗糖酶次之、过氧化氢酶最小。

由表7可以看出，以化学性状为自变量，酚酸类物质为因变量，通过逐步回归分析剔除无关变量后，拟合出间苯三酚、对羟基苯甲酸和酚酸类物质总量与pH的回归方程，说明pH对这3种酚酸有影响，其他土壤理化性状对其他酚酸类物质无显著影响。从回归方程的标准化系数来看，pH对间苯三酚、对羟基苯甲酸和酚酸类物质总量均有具有抑制作用。

表6 酶活性与酚酸类物质的逐步回归分析Table 6 Stepwise regression analysis of enzymes activities and phenolic compounds

表7 土壤理化性状与酚酸类物质的逐步回归分析Table 7 Stepwise regression analysis of soil physiochemical properties and phenolic compounds

3 结论与讨论

本研究将酚酸类物质作为土壤环境中的重要组分，初步明确了其与土壤中其他主要环境因子(理化性状和酶活性)的相互关系，并在此基础上利用逐步回归分析进一步探讨酚酸类物质与土壤酶活性、理化性状的相互关系，研究结果进一步明确了酚酸类物质在连作土壤中的积累特征以及与土壤主要因子的关系，对今后深入开展酚酸类物质与环境因子的相互作用研究提供了一定的理论依据。

前人对茄子［13］、大豆［14］、苹果［32］和草莓［33］的连作研究表明，酚酸类物质在连作土壤中积累并在某种程度上导致了连作障碍的发生。植株通过根系向周围土壤环境分泌酸类物质是土壤中酚酸类物质的主要来源之一，随着烤烟连作年限增加，酚酸物质逐渐积累并参与土壤各种生理生化过程［34］。本实验在前人研究的基础上，利用高效液相色谱在不同连作年限的植烟土壤中检测出了8种酚酸类物质，分别为间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，其中，间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、香兰素的含量和酚酸类物质总含量均随着连作年限的延长而表现出升高的趋势，说明随着连作年限延长，酚酸类物质在土壤中表现出富集效应。

业已证明，连作对土壤酶活性和土壤养分具有重要影响［35－38］，本研究也得到相似结论:随着连作年限延长，过氧化氢酶、脲酸、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性的变化趋势均表现为先升高后降低，且酶活性峰值出现在不同年限;土壤中pH值、有机质和全N含量均不同程度下降，有效K含量增加，全磷、全钾、碱解氮和有效磷随着连作年限延长呈现出先降低后升高的趋势。总体而言，连作导致植烟土壤酸化和养分失衡。

受研究方法和手段的限制，前人相关研究大多以描述性为主，并未对连作土壤理化性状、酶活性与酚酸类物质的相互作用机制及相互影响进行探讨［22－23］。本研究利用相关性分析发现，土壤中酚酸类物质与酶活性、理化性状具有相关性，并利用逐步回归模型进一步探究了其相互影响。逐步回归分析结果显示，虽然土壤中酚酸类物质和酶活性具有相关性，但通过逐步回归分析剔除无关变量后发现，酚酸类物质对酶活性的影响较小，而酶活性对酚酸类物质却有较大的影响。这种影响可能是通过微生物的活动等某些不确定的因子相互作用产生的［19，21］。酚酸类物质除与土壤pH相关外，与土壤养分并无显著相关性，逐步回归分析进一步发现，pH对间苯三酚、对羟基苯甲酸和酚酸类物质总含量存在抑制作用，即pH越低，酚酸类物质积累越明显，这在一定程度上说明连作导致植烟土壤酸化是使酚酸类物质积累的一个因子，因此，可通过调节土壤pH值来缓解植烟土壤中酚酸类物质的积累，从而缓解连作带来的一系列问题。这与李亮亮等［30］对酚酸类物质在土壤中降解的研究结果一致。酚酸类物质与土壤理化性状的逐步回归分析还显示，除间苯三酚对pH有影响外，其余酚酸类物质对其他土壤理化性状指标并无直接影响。考虑到酚酸类物质与酶活性的互相影响，可以认为酚酸类物质会通过影响酶活性等因素来对植烟土壤理化性状间接产生影响，从而进一步加剧连作土壤的养分失衡。本文结果从统计分析的角度初步阐述了酚酸类物质与酶活性、理化性状的相互影响。在此基础上，可通过外源添加酚酸等方式来进一步验证其对土壤各环境因子的影响，从而进一步明确酚酸类物质在连作植烟土壤中的作用机制。