陆 娜，王伟科，宋吉玲，袁卫东，闫 静

（杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），原产于印度，又名印度鲍鱼菇，隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目 （Agaricales） 白蘑科 （Tricholomataceae） 侧耳属（Pleurotus），属于平菇大类中的肺型侧耳，原系热带和亚热带的1种野生食用菌，经驯化育种后开始人工栽培[1]，秀珍菇是近年来从众多食用菌品种中脱颖而出的最受消费者喜爱的优良食用菌品种之一[2]。随着秀珍菇设施栽培模式的不断更新和改进，由传统春秋两季栽培模式逐渐向栽培效率和收益更高的夏季设施栽培模式发展，然而适合高效设施栽培的环境专用型品种却未能得到及时有效地更新同步，可供企业、菇农选择的栽培品种较少，同时已应用的品种经常出现异种同名或同种异名现象，因此造成秀珍菇品种混乱[3]，加上秀珍菇设施栽培生产中常出现菇体色泽不佳、菇盖薄、易破碎、出菇整齐度不高等问题，目前急切需要色灰、盖厚、不易碎、出菇整齐度高，适应反季节设施栽培模式的优质秀珍菇品种，以满足市场不断提高的质量要求，为促进杭州市秀珍菇产业健康稳步发展提供品种和技术支撑。ISSR分子标记技术可以辅助提供有效的基因组信息，在侧耳的分子系统发育学研究中具有可行性，能快速确定各栽培菌株之间的遗传关系，其可以产生丰富的多态位点，更好地揭示了种下分类群间的关系[4]。因此，采用ISSR分子标记技术并结合秀珍菇栽培特性进行种质遗传多样性分析，旨在为筛选出适合高效设施栽培的秀珍菇菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和来源

供试的36个秀珍菇菌株均由杭州市农业科学研究院蔬菜所菌种站从秀珍菇主产区收集，经过扩繁培养，采用同一菌龄的菌株开展试验后所得，详见表1。

1.2 培养基和培养方法

菌丝体培养：从PDA平板上培养3 d的菌落边缘取2 mm×2 mm的菌丝块，接种于100 mL PDA液体培养基中，25℃浅层静置培养10 d，收集菌丝，无菌水漂洗2次后，无菌滤纸吸干水分，于-80℃保存备用。

母种培养：采用PDA培养基，在无菌条件下进行接种后放置于25℃培养箱内培养10 d左右，于-4℃保存备用。

原种培养：采用棉籽壳78%、麸皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量为65%的培养基，高压灭菌后在无菌条件下接种，放置于25℃培养箱内培养。

栽培种培养：采用棉籽壳39%、木屑39%、麸皮20%、石灰2%，含水量为63%的培养基，高压灭菌后在无菌条件下接种，放置于25℃培养箱内培养。

1.3 秀珍菇基因组DNA的提取和浓度测定

供试的36个秀珍菇菌株的DNA提取方法参照新型快速植物基因组DNA提取试剂（百泰克生物技术有限公司BioTeke，北京） 的说明，提取后测定DNA浓度，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃保存备用。

1.4 ISSR引物选择

从美国哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR通用引物中筛选出18条ISSR引物，具体见表2，然后委托杭州擎科生物公司进行合成。

1.5 ISSR多态性分析

ISSR-PCR的扩增体系为：2×TSINGKE PCR Maste（rblue）预混体系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）3 L，加 dd H2O 补齐到 20 μL。

ISSR的PCR扩增反应在TC-XP型（博日科技有限公司Bioer，杭州）上进行。反应条件为94℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，适当退火温度退火30 s（退火温度视引物而定，详见表2），72℃延伸90 s，35个循环；72℃延伸7 min，于16℃保存。

PCR扩增后产物采用1.5%的琼脂糖凝胶（EB染色）进行电泳检测，150 V下电泳30 min。扩增图谱的摄取采用Chemi Doc XRS imaging system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA） 进行拍照，有ISSR带谱的统计为1，无ISSR带谱的统计为0，构建初始数据矩阵，采用NTSYSpc2.1软件计算遗传相关系数，非加权组平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means） 进行聚类分析，得出聚类图谱。

表1 供试秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus geesteranus

表2 ISSR引物名称及退火温度Tab.2 The name of ISSR primers and the annealing temperature

1.6 出菇试验

出菇试验在秀珍菇设施化栽培大棚中进行，每个菌株挑取发菌完好的菌袋150袋，每50袋1次重复，设3次重复，每袋干料重650 g。以优质高产为主要指标进行筛选，记录前3潮产量和各菌株农艺性状。

2 结果与分析

2.1 ISSR多态性分析与菌株聚类

ISSR多态性分析与菌株聚类试验，结果见图1。

图1 引物UBC827的PCR扩增图谱Fig.1 PCR amplification map of primer UBC827

由图1可以看出，利用ISSR引物对36个秀珍菇菌株的基因组进行PCR扩增，ISSR-PCR扩增图谱显示，其中18条ISSR引物在36个秀珍菇菌株间扩增出146条清晰、稳定的多态性片段，片段长度在 500 bp～2 000 bp。

2.2 DNA扩增图谱聚类分析

基于ISSR扩增图谱进行36个秀珍菇菌株DNA扩增图谱聚类分析，结果见图2。

图2 基于ISSR分析的秀珍菇菌株聚类树状图Fig.2 Cluster dendrogram of Pleurotus geesteranus strains based on ISSR analysis

由图2可以看出，不同来源秀珍菇菌株遗传相似系数在0.66～1.00，当相似系数为0.66时，其可被分为2个类群；当相似系数为0.82时，被分为4个类群；而当相似系数为1.00时，被分为7个类群。其中秀珍菇菌株X18和X27聚为1组；菌株X15、X38、X28、X29聚为1组；菌株X13、X31、X12、X35各为单独1组；其余26个秀珍菇菌株聚为1组，相似系数为1.00，很有可能为同一个菌株。36个秀珍菇菌株的遗传相似系数变异范围在0.66～1.00，表明秀珍菇遗传差异较大，背景丰富。

2.3 菌株农艺性状比较

通过遗传多样性分析，从36个秀珍菇菌株中选择9个代表性菌株，按编号1～9分别是X3、X4、X28、X11、 X35、X23、X12、 X27、X31，主栽菌株TX5766（编号为10）作为对照品种，进行出菇试验并评价。

2.3.1 秀珍菇菌株菌丝长势和产量比较

秀珍菇菌株菌丝长势和产量比较，结果见表3。

从表3可知，各秀珍菇菌株平均满袋天数和产量间均存在显著差异。菌丝生长最快的是4号、10号菌株，满袋天数分别为45 d和45.5 d；最慢的是1号菌株，满袋天数为50 d。从前3潮菇产量来看，5号菌株平均产量最高，达0.326 kg·袋-1，其次是10号菌株，为0.283 kg·袋-1，5号菌株平均产量比对照菌株高15.2%；而其余参试菌株的平均产量均低于主栽对照菌株10号。

表3 秀珍菇菌株产量比较Tab.3 Comparison of yields of Pleurotus geesteranus

2.3.2 各参试菌株栽培和商品性状比较

各参试菌株栽培和商品性状比较，结果见表4。

由表4可知，秀珍菇5号、10号、8号3个菌株菌盖颜色深灰色，比较符合市场中菌盖色深的要求；而从出菇密度方面分析，秀珍菇5号、10号、1号和2号菌株出菇密度比较高；从成菇率方面分析秀珍菇5号和10号菌株较高；从菌盖平展度方面分析，秀珍菇3号、10号和8号菌株整体菇型更秀美。综合分析农艺性状，秀珍菇5号、3号菌株比较符合市场需求。

3 小结

ISSR分子标记技术是鉴别食用菌菌株遗传多样性的常规方法，其具有非常高的多态性，使用的引物较长、退火温度较高，相对于SRAP、RAPD分子标记技术有较强的稳定性和重复性，比较能够准确反映出菌株间的亲缘关系，已广泛应用到秀珍菇、香菇、金针菇、银耳等食用菌遗传鉴定中。本试验利用ISSR引物对36个秀珍菇菌株基因组DNA进行PCR扩增，发现秀珍菇菌株的遗传相似系数变异范围在0.66～1.00，将36个秀珍菇菌株聚为7个群，这表明秀珍菇遗传差异较大，背景丰富。

表4 秀珍菇菌株栽培和商品性状Tab.4 Cultivation and commercial characteristics of Pleurotus geesteranus strains

研究秀珍菇菌株的遗传背景后，从不同类群中挑选出具有代表性的秀珍菇菌株进行反季节设施栽培出菇试验，通过产量、农艺性状等综合数据分析后得出，5号菌株表现较为突出，产量比常规对照菌株高15.2%，并且在子实体色度、出菇密度、成菇率等性状方面表现最好，符合市场需求。可见，秀珍菇5号菌株为值得推广的设施栽培菌株。