周杨 张亦默 王嘉伟 林莉 刘冬云 孟庆瑞

(河北农业大学，保定，071000)

美女樱与细叶美女樱是优良的草本花卉，原产于热带至温带美洲，近年来，以其优良的观赏特性和广泛的适应性在我国园林应用中崭露头角，开始应用在观花草坪、花坛、花境、盆花和地被栽植中，逐渐被人们认识、接受和喜爱[1-2]。但当前的研究除主要局限在栽植养护[3-4]层面外，仅有少量组织培养[5]、杂交种间亲和研究等[6-9]，不足以为种质创新和遗传改良创造基础。核型分析主要通过研究其染色体数及染色体形态特征来反映不同物种或品种之间存在的染色体细胞学差异，是从细胞层面研究种间遗传变异、系统演化以及亲缘关系。

本研究首次对美女樱与细叶美女樱进行了细胞学研究，以国内外常用的10个美女樱与细叶美女樱种(品种)为试验材料，根据其染色体数目及形态特征进行分析,并探究其进化趋势，旨在为后续的杂交育种、基因定位等提供必要的细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为10个美女樱与细叶美女樱种(品种)培根的根尖，名称详见表1。

表1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 染色体制片方法

使用胚根作为试验材料。将种子消毒后置于光照培养箱中15～20 ℃培养，待其胚根长为0.5～1.5 cm时，于09:00—10:00取出并置于冰水混合物中24 h进行预处理。然后将胚根置于固定液(V(冰乙酸)∶V(无水乙醇)=1∶3)中，在冰箱中4 ℃固定24 h(或放置于70%的酒精中，置于冰箱中4 ℃保存备用)；然后将胚根放入1 mol·L-1盐酸解离液中，在60 ℃恒温水浴中解离。解离时间设为6、8、10、12 min四个时段。取胚根根尖尖端1～2 mm白色球状分生组织，滴加改良石炭酸品红溶液，染色8～12 min；染色完成后盖上盖玻片，垂直压片，将其轻轻敲打至材料呈雾状；而后将压片置于莱卡显微镜下，在10×100倍油镜下滴油观察，各试验材料各选取30个左右染色体分散良好的细胞进行染色体计数，以确定染色体数目，并用计算机进行显微摄影。

1.2.2 数据分析

从镜检照片中选取5个染色清晰、分散较好、着丝点较为明显的细胞进行染色体核型分析。用莱卡显微镜软件和ImageJ软件测量各个细胞中染色体长臂和短臂的绝对长度，参照乔永刚等[10]所述方法利用EXCEL软件制作核型模式图，按照李懋学等[11]提出的标准进行分类分析，用Levan提出的公式计算相对长度[12]，用Stebbins[13]提出的方法将染色体核型按对称性程度的不同分为12种类型(1A～4C)，1A为最对称核型,4C为最不对称核型，参照Arano[14]提出的方法计算核型不对称系数(As，K)，并用Photoshop和Excel软件进行辅助分析。具体核型分析标准如下：

染色体长度比=最长染色体长度/最短染色体长度；

臂比值=长臂长度/短臂长度(精确到0.01)；

根据臂比值将染色体按表2进行分类，以确定着丝点的位置；

按表3核型分类标准进行核型分类；

核型不对称系数(As，K)=(长臂总长度/全组染色体总长度)×100%。

2 结果与分析

2.1 染色体核型特征

各种(品种)均为二倍体种，染色体基数为x=5(表4)，根尖细胞中的染色体数目均为2n=2x=10。染色体镜检照片见图1，染色体核型模式图见图2，主要核型参数见表4，染色体核型图见图3。

图1 10个美女樱与细叶美女樱种(品种)染色体照片

A.细叶美女樱‘祥和’；B.细叶美女樱‘梦幻曲’；C.美女樱(蓝)；D.美女樱‘托斯卡纳’(玫红)；E.美女樱‘托斯卡纳’(蓝)；F.美女樱‘水晶’；G.美女樱‘石英’(猩红)；H.美女樱‘石英’(红)；I.美女樱‘石英’(粉)；J.美女樱‘魔力紫’。

图2 10个美女樱与细叶美女樱种(品种)核型图

表3 核型分类标准

注：N为臂比大于2的染色体所占百分比。

由表4可以看出，美女樱、细叶美女樱以两种染色体为主(m，sm)，同时出现了st型染色体，基本由3种染色体(m，sm，st)组成。‘石英’(红)中出现了单个随体，处在m染色体上。细叶美女樱和美女樱的染色体中m(中部着丝点区)和sm(近中部着丝点区)染色体所占的比例大。

由表4可知，美女樱的核型分为1A、2A两种，其中‘美女樱’(蓝)、‘托斯卡纳’(玫红)、‘托斯卡纳’(蓝)、‘水晶’、‘石英’(红)为1A型，‘石英’(猩红)、‘石英’(粉)、‘魔力紫’为2A型。细叶美女樱均为2A型。最长臂与最短臂的比值，美女樱为1.17～1.46、细叶美女樱为1.21～1.52。臂比值大于2的染色体的比例，美女樱占0～20%、细叶美女樱占20%～40%。核型不对称系数差别不大，为55.54%～62.33%。由如上信息可见，美女樱和细叶美女樱核型对称性高，其中美女樱的对称性更为明显，其中5个品种未出现臂比值大于2的染色体，细叶美女樱的对称性普遍差于美女樱。

纵坐标零点以上部分为短臂模式图；纵坐标零点以下部分为长臂模式图。

2.2 核型参数散点图分析

核型越不对称该物种越进化[13]。图4以平均臂比和染色体长度比来衡量染色体的不对称性，越在右上的品种越不对称，其进化程度越高。供试材料中仅美女樱(蓝)和‘托斯卡纳’(玫红)在染色体长度比方向高于平均臂比方向，其余品种均是在平均臂比方向进化程度高。其中‘梦幻曲’在两个方向进化程度均最高。

表4 10个美女樱与细叶美女樱种(品种)核型参数

图4 供试材料核型不对称程度散点图(MAR-LR)

图5以平均臂比和核型不对称系数从另一个角度反映了核型的不对称性，越靠近图的右上角，越不对称，则越进化，供试的10个品种均按平均臂比和核型不对称系数向右上角方向进化，且与图4相比，更为线性，在两个方向的进化速度更为一致。其中‘梦幻曲’进化程度最大，最为进化，‘托斯卡纳’(玫红)、‘石英’(猩红)、美女樱(蓝)则较原始。

图5 供试材料核型不对称程度散点图(MAR-As.K)

3 结论与讨论

植物有着明显的生物节律性，不同时间植物有丝分裂的旺盛程度不同，选择在有丝分裂高峰进行取材，所获得的样片中分裂相所占比例便较大，前人通过实践研究，得出有丝分裂高峰普遍集中在08:00—12:00，不同物种间有所差异[15-16]，通过本试验的观察，美女樱与细叶美女樱的取材时间为08:30—09:30。

在解离过程中找到适合的解离时间对观察效果至关重要，时间过短，会导致解离不充分，如果解离的时间过长，会使解离过度[17]，进而影响观察效果，所以解离时间是能否找到清晰细胞分裂相的一个重要因素。本试验比较了1 mol·L-1HCl解离液在不同时间梯度下的解离效果，解离时间过短，不能充分软化细胞壁中的纤维素和果胶，细胞不易压散，镜下呈现出细胞难以分散，重叠聚集，难以观察，所以得不到清晰的细胞分裂相；当解离时间过长时，细胞过于散碎，染色体太分散，染色较浅，且呈现出细胞膜消失，染色体四散，不易观察[18]。

不同试验材料的解离结果也有着明显差异，细叶美女樱解离时间普遍较美女樱短，即细叶美女樱更易解离。解离6 min时，细叶美女樱细胞单层排列，染色体形态自然，易于染色，美女樱细胞重叠聚集，无法观察到清晰的染色体形态；解离8 min时，细叶美女樱细胞分散，染色体形态自然，易染色，美女樱细胞单层排列，染色体形态自然，易于染色；解离10 min时，细叶美女樱细胞膜消失，染色体分散，美女樱细胞分散，染色体形态自然，易染色；解离12 min时，细叶美女樱细胞膜消失，染色体分散，染色浅，美女樱细胞分散，细胞膜消失，部分染色体四散，因此，细叶美女樱最佳解离时间为6 min，美女樱为8 min，解离时间的不同可能是由于细胞壁结构、物质质量分数的差异。

美女樱与细叶美女樱各品种均为二倍体，染色体基数为x=5，染色体数目均稳定为2n=2x=10，相似的核型说明它们在物种性和亲缘关系存在一致性。此外，它们均以两种染色体为主(m，sm)，有的品种同时出现了st型染色体。随体出现在核型中的位置、数目不固定，所以随体在细胞学鉴定中不是一种可靠的性状，仅在杂种早期鉴定中可适当采用[19]，供试品种中‘石英’(红)中出现了单个随体，处在m染色体上，通常染色体带有居间随体会导致植物出现不育现象[20]，染色体类型的不同和随体的有无也说明它们品种间的多样性。

根据Stebbins对染色体核型按对称性的研究，认为染色体的对称性与进化程度呈反比。核型不对称性的衡量可通过平均臂比和染色体长度比来表达[13]。本研究的美女樱的核型分为1A、2A两种，细叶美女樱均为2A型，均是对称性很高的类型，表明美女樱与细叶美女樱属于较原始的类型[13]。过往有学者对同为马鞭草科的海州常山[21]、蒙古莸[22]进行核型分析，得出其核型分别为2A、2B型，同样为较为原始的类型。

刘慧民等[23]在此基础上对染色体核型参数的重要性进行排序，由大到小的顺序为核型不对称系数、平均臂比、臂比大于2的染色体、染色体长度比、核型类型。但核型类型由臂比大于2的染色体得出，故笔者认为核型类型与臂比大于2的染色体选择其一作为判定进化趋势的主要染色体参数。通过比较10个美女樱与细叶美女樱种(品种)的相关核型参数可知，核型不对称系数数据由大到小的顺序为‘梦幻曲’、‘石英’(粉)、‘托斯卡纳’(蓝)、‘石英’(红)、‘魔力紫’、‘水晶’、‘祥和’、美女樱(蓝)、‘托斯卡纳’(玫红)、‘石英’(猩红)；平均臂比值由大到小的顺序为‘梦幻曲’、‘石英’(粉)、‘魔力紫’、‘托斯卡纳’(蓝)、‘石英’(红)、‘祥和’、‘水晶’、‘石英’(猩红)、美女樱(蓝)、‘托斯卡纳’(玫红)；染色体长度比由大到小的顺序为‘梦幻曲’、美女樱(蓝)、‘托斯卡纳’(蓝)、‘石英’(粉)、‘石英’(红)、‘祥和’、‘托斯卡纳’(玫红)、‘水晶’、‘石英’(猩红)、‘魔力紫’。

平均臂比、核型不对称系和染色体长度比是衡量染色体对称性的主要标准，通过图4、图5可以看出，供试10个品种均向右上进化，两图整体表现出同样的进化取向，但某些品种表现出了差异性，‘梦幻曲’进化程度均是最大，‘托斯卡纳’(玫红)、‘石英’(猩红)则均较原始，但也有一些品种表现出了不一致，如美女樱(蓝)在染色体长度比方向显示出较高的进化程度。邢世岩等[24]在研究中将一些种沿染色体长度比方向进化快，一些种沿平均臂比方向进化快的现象归纳为核型的“双向进化趋势”，美女樱(蓝)即是在染色体长度比方向的进化程度高于平均臂比方向，本研究中的细叶美女樱与美女樱皆呈双向进化趋势，美女樱(蓝)和‘托斯卡纳’(玫红)在染色体长度比方向进化快，其余品种均是在平均臂比方向进化速度快。