李雪艳，张 涛，杨红梅，楚 敏，高 雁，曾 军，霍向东，张 涛，林 青，欧提库尔，李玉国，娄 恺,史应武,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆 乌鲁木齐 830091)

【研究意义】内生细菌生活于组织内部，能够促进棉花生长，有些能够抑制黄萎病菌生长[1-5]。内生细菌种类、定殖率和定殖量等因素直接影响细菌对宿主植物的效应。如何在短时间高灵敏度，高特异性地进行高通量定量内生细菌，研究内生细菌数量在季节和空间上的动态变化，为新疆不同地区和不同季节棉花黄萎病(Verticilliumdahliae)防治提供理论依据。因此棉花黄萎病株内生细菌数量的研究对揭示棉花黄萎病发生对内生细菌的影响及微生态调控黄萎病具有重要意义。【前人研究进展】棉花黄萎病是一种土传病害，从棉花的根部侵染，进入维管束造成棉花系统性症状[6]具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播通径多，存活时间久等特点，被称为棉花的癌症[7-8]。在中国大约有30 000 km2的棉花感染了黄萎病，年损失率达到10 %～30 %[9]。传统防治黄萎病的方法是通过培育部分抗性品种，但很少有陆地棉品种能够抗黄萎病，这种方法不仅繁琐耗时，而且综合防控效果不佳。在生态环境中，绝大多数化学杀菌剂不能有效地抑制甚至杀死病原菌。因此，几乎没有任何化学措施能有效地控制这种疾病[10]。生物防治是目前最具发展潜力的植物防治方法，但根际微生物防治黄萎病效果不稳定且受环境因子的影响不易控制[11]。而植物内生细菌能在健康植物组织内栖居，而不对植物造成实质性危害，并与植物建立和谐联合关系，具有防止病害，增强抗逆性的生物学作用[12],它的优势在于操作方便,不受环境影响且对环境安全可靠。因此使用生防菌，特别是内生细菌，是控制该病的一种替代策略。不同内生细菌菌株在棉花体内的定殖规律不同且在棉苗中定殖一定数量后，才能对棉花黄萎病产生较高的防治效果[13-14]。因此，对棉花黄萎病株不同季节和地区的内生细菌进行定量，为内生细菌防治棉花黄萎病提供科学依据。【本研究切入点】细菌定量检测方法有细菌培养技术，多重PCR[15]，荧光定量PCR等。细菌培养技术比较费时费力，且对操作人员技术和设备要求较高[16]；多重荧光定量PCR由于引物之间的竞争，检测常常受到限制，检测后还需进一步凝胶电泳分析，操作繁琐[17]；荧光定量PCR具有高通量，快速，灵敏自动化程度高[18-20]等特点，能够较短时间内完成检测与定量，技术成熟，应用广泛，然而实时定量PCR应用于定量检测棉花内生细菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以新疆棉花内生细菌为研究对象，采用实时荧光定量方法，揭示罹病棉花内生细菌的时空动态规律，了解黄萎病对棉花内生细菌的影响，为内生细菌防治棉花黄萎病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 实验室棉花样品采集 在新疆东疆哈密(HM)，南疆库尔勒(KEL)、阿拉尔(ALE)、盘木舒克(PMSK)，北疆乌苏(WS)、精河(JH)、石河子(SHZ)这7个地区分别在苗期、蕾期、花期、吐絮期采集整个病株棉花样品，放入装有变色硅胶保鲜袋脱水带回。

1.1.2 主要试剂及仪器 试剂：Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，购自生物工程(上海)股份有限公司； 质粒纯化试剂盒，购自生物工程股份有限公司；dNTP Mixture，购自宝生物工程有限公司。仪器：荧光定量PCR仪，LightCycler 480，罗氏医学仪器公司；超微量分光光度计，OSE-260，济南利科医疗器械有限公司；全自动凝胶成像系统，WD-9413B，北京市六一仪器厂；超低温冰箱,DW-40L255,杭州艾普仪器设备有限公司；PCR仪，TC-96，杭州博日科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花内生菌总DNA提取 随机选取每个棉区苗期、蕾期、花期、吐絮期各3棵棉花植株，共84个样品，用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒按照试剂盒的实验步骤提取棉花总DNA，每个样品分别对应标记，将DNA提取的样品放置在-20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 样品PCR扩增及反应系统的优化 选用内生细菌16S rDNA基因特异引物，正向引物 799F 5′-AAC AGG ATT AGA TAC CCT G-3′和反向引物1392R 5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′扩增内生细菌16S rDNA基因片段，探针用fam/BHQ1(CCGTCAATTCMTTTGAGTTT)标记，同时设置不加模板的为阴性对照组，每个反应体系重复3次，对棉花内总DNA进行实时荧光定量PCR扩增。根据扩增效率最终确定PCR优化反应体系为20 μl，mix 10 μl，引物0.8 μl，探针0.4 μl，水7.8 μl，模版1μl反应程序为95 ℃予变性10 min，95 ℃变性25 s，52 ℃退火120 s，72 ℃延伸90 s，45个循环。

1.2.3 重组质粒的构建 将棉花内总实时荧光定量PCR扩增产物经全自动凝胶成像系统纯化。将纯化的内生细菌扩增产物构建质粒后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,在平板上进行蓝白斑试验筛选阳性克隆。

1.2.4 重组质粒的标准曲线的建立 利用质粒纯化试剂盒提取上述阳性克隆重组质粒DNA,用超微量分光光度计(OSE-260)测定重组质粒DNA的浓度。根据已知重组质粒全序列和阿伏伽德罗常数(6.02×1023分子数·mol-1)计算拷贝数为1.8825×107copies/g(FRW)。7个10倍梯度稀释重组质粒拷贝数范围：1.8825×107copies/g(FRW)，1.8825×106copies/g(FRW)，1.8825×105copies/g(FRW)，1.8825×104copies/g(FRW)，1.8825×103copies/g(FRW)，1.8825×102copies/g(FRW)，1.8825×10 copies/g(FRW)。以循环数为纵坐标，以拷贝数的对数为横坐标做标准曲线，在Roche LightCycle 480软件内拷贝数据，用Origin 94C软件重新作出该图，建立Ct值与内生细菌浓度之间的线性关系。

1.2.5 不同时空样品的荧光定量PCR检测 利用上述重组质粒DNA构建的标准曲线对不同季节棉花内生菌DNA样品进行荧光定量PCR检测。每个样品在优化反应体系条件下进行PCR扩增，RT-PCR检测扩增后的内生细菌的量；检测完毕后得到Ct值，并将每个样品对应的Ct值带入标准曲线方程中，记录苗期，蕾期，花期，吐絮期及所对应地区的内生细菌的含量(copies g-1FRW)。

1.2.6 数据处理 使用Prism5和Origin94C软件绘图。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的标准曲线的建立

以拷贝数1.8825×107copies/g(FRW)为基础，稀释6个10倍稀释梯度，重组质粒拷贝数范围为：1.8825×106copies/g(FRW)，1.8825×105copies/g(FRW)，1.8825×104copies/g(FRW)，1.8825×103copies/g(FRW)，1.8825×102copies/g(FRW)，1.8825×10 copies/g(FRW)。以这7个标准浓度的DNA为模板进行PCR扩增，以反应结束后LightCycler®480系统软件提供的数据，用Origin作图1～2。

图1 10倍梯度稀释阳性质粒的荧光定量PCR扩增曲线Fig.1 Real-time PCR amplification curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

图2 10倍梯度稀释阳性质粒的荧光定量PCR标准曲线图Fig.2 Real-time PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

由图2可知，曲线的相关性系数R2=0.997，说明模版的浓度与循环数Ct之间有相关性强；曲线的截距为42.09645± 0.52988，斜率为-3.31684± 0.08222。故内生细菌的DNA起始浓度对数值与Ct值之间的标准曲线方程为y=-3.317x+42.096，其中x为内生细菌DNA起始浓度的对数值，y为扩增反应Ct值。

2.2 棉花黄萎病株内生细菌在季节上的变化规律

由图3可以看出，整体上除了哈密外其余6个城市在苗期、蕾期、花期均表现出先上升后下降再上升的趋势；苗期精河达到最低值，平均值为2.32×107copies/g(FRW)，蕾期图木舒克平均值最高，达1.35×108copies/g(FRW)，花期石河子最低，平均值达1.267348×107copies/g(FRW)，吐絮期库尔勒平均值最高，达2.31×108copies/g(FRW)。图木舒克、乌苏、石河子、阿拉尔的棉花黄萎病病株的内生细菌数量在4个时期中均在蕾期达到最高；库尔勒，精河病株的内生细菌数量在4个时期中在吐絮期达到最高；哈密地区的病株内生细菌量呈现出先下降再上升的趋势，在花期内生细菌的量达到最低达2.085539×107，苗期最高达3.96×108。

图3 棉花黄萎病株内生细菌数量在季节上的变化Fig.3 Different growth stages changes of the total number of endophytic bacteria in cotton infected by Verticillium wilt

图4 棉花黄萎病株内生细菌数量在空间上的变化Fig.4 Sampling sites changes of the total number of endophytic bacteria cotton infected by Verticillium wilt

2.3 棉花黄萎病株内生细菌在空间上的变化规律

图4表明棉花黄萎病株内生细菌数量在空间上的变化规律，整体来说病株的内生细菌数东疆最高，南疆其次，北疆相对较少。其中东疆哈密的苗期高达3.96×108copies/g(FRW)，库尔勒吐絮期高达2.31×108copies/g(FRW)；南疆库尔勒，图木舒克和阿拉尔的病株蕾期的内生细菌数量均高于北疆精河石河子和乌苏病株蕾期内生细的菌量。

3 讨 论

实时荧光定量 PCR 检测方法快而灵敏且特异性强，更突破了传统的PCR的仅检测而不能定量的局限，现已广泛应用于植物细菌、真菌以及病毒病原的检测与定量[13]。棉花黄枯萎病是棉花的癌症，病原菌和拮抗菌的大规模检测和定量方法的建立和应用是生物防治的一种非常重要的手段，实时荧光定量PCR能够满足大规模的检测的需求，但设备和试剂昂贵。本实验就是利用实时荧光定量PCR的方法定量棉花患黄萎病植株内生细菌的数量，探究出了棉花患病内生细菌的含量与空间和季节的变化规律，但这7个地区的病株内生细菌的数量与病株体内大丽轮枝菌数量的关系，以及各生育时期罹病植株内生细菌的定殖量与棉花黄萎病发病程度的相关性有待进一步研究。

4 结 论

本研究应用荧光定量PCR快速检测定量新疆南疆，北疆，东疆部分地区及对应地区不同季节黄萎病棉花内生细菌，新疆棉花内生细菌数量在季节上呈“升-降-升”和空间上从东疆、南疆、北疆依次降低的变化趋势。