马琪林 井初雅 吕哲 郑良城 洪甘济 方杰

组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)基因, 位于11号染色体, 可编码形成功能蛋白 CTSD［1］。有文献报道, CTSD基因224 处 C～T ［Ala～Val］多 态 与 阿 尔 茨 海 默 病 (alzheimer’s disease, AD)相关, 携带CTSD-T等位基因的个体比不携带T等位基因的个体患AD的几率增加了3.1倍［2］, CTSD-C/T多态性会增加晚发型AD的患病风险［3］。在对于动脉粥样硬化的发病机制研究中有结果显示CTSD和NF-κB的表达有相关性［4］, 提示CTSD可能会有抑炎作用, CTSD-T突变体可能与AD中的炎症反应相关。本研究检测了APP/PS1小鼠和野生型小鼠大脑内CTSD的表达情况, 并构建了Ctsd基因敲除小鼠, 检测其中各类促炎和抑炎因子的表达变化, 从而研究CTSD在AD免疫机制中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 Ctsd基因敲除小鼠由广州赛业生物科技有限公司构建, APP/PS1小鼠和WT小鼠由厦门大学神经科学研究所提供, 在厦门大学实验动物中心进行饲养和繁殖, 饲养温度22～25℃, 空气湿度为50%, 12 h明暗交替。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技术 剥离小鼠脑组织, Trizol法提取总RNA, 逆转录合成cDNA, 稀释引物浓度至10 μM的工作浓度 , 按照 2 ×SYBR Green Master 5 μl；Forward primer(10 μM)0.3 μl；Reverse primer (10 μM)0.3 μl；cDNA Template 10 ng ；Nuclease-free Water up to 10 μl进行混合。将反应板置于 Light Cycler 480荧光定量 PCR 仪中, 最后用2-△△CT方法进行数据分析。

1.2.2 Western blot技术 使用解剖器械取出小鼠脑组织,裂解、匀浆后制备样本。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 将SDS-PAGE胶上的蛋白通过电转移到 PVDF膜上。电转过后的PVDF膜用TBS/T洗膜液清洗, 封闭2 h后加入一抗溶液,4℃包被过夜。洗涤后加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液, 室温孵育1 h。再次洗涤后用新配制的增强型化学发光剂溶液浸润, 迅速于全自动化学发光仪曝光。

1.2.3 免疫组织化学 将小鼠麻醉灌注固定后取脑, 置于4% PFA中固定6 h, 然后蔗糖梯度脱水。……