殷雪艳　杨柳

摘 要：以ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1为材料，采用生物数据分析工具对烟草的半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列进行分析，分别以GSDS、MEME和SignalP 4.1工具对其基因结构、保守基序和信号肽进行检测。结果显示，NtCP-1和NtCP-2基因具有7个外显子， NtCP-3和NtCP-4基因含有4个外显子，NtCP-5基因具有3个外显子，NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5基因具有上游序列，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-4和NtCP-5基因具有下游序列；检测NtCP共有5个Motif，其核心保守基序區为Motif-1—Motif-2—Motif-4，且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶结构域中，Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸和谷氨酰胺；NtCP均属于信号肽，NtCP-1和NtCP-2的信号区分布相同（1 ～ 22），NtCP-3和NtCP-4的信号区分布相同（1 ～ 20），NtCP-5的信号区为1 ～ 29。

关键词：烟草； 半胱氨酸蛋白酶；基因序列；蛋白序列

中图分类号：S572 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.09.001

Gene and Protein Sequence Analysis of Cysteine Protease in Tobacco

YIN Xueyan， YANG Liu， LUO Wanlin， ZHAO Shuang， LIU Biao， WANG Guangyun

（Liangshan Tobacco Company， Xichang，Sichuan 615000，China）

Abstract：ABW71226.1， BAA96501.1， ACB70409.1， AAW78660.1 and ADV41672.1 were as experimental materials， the tobacco cysteine protease genes and protein sequences were analyzed using biological data analysis tools including GSDS， MEME and SignalP 4.1. The results showed that NtCP-1 and NtCP-2 genes had 7 exons， NtCP-3 and NtCP-4 genes contained 4 exons， NtCP-5 gene had 3 exons， NtCP-1， NtCP-2 and NtCP-5 genes had the upstream sequence， NtCP-1， NtCP-2， NtCP-4 and NtCP-5 genes with the downstream sequence. 5 motifs were detected in NtCP， in which the core conserved motif region was Motif-1-Motif-2-Motif-4， and located in cysteine protease domain of the papain family， Motif-1 and Motif-2 contained cysteamine acid and glutamine. NtCP belonged to the signal peptide， the signal area of NtCP-1 and NtCP-2 were the same （1～22）； the signal regions of NtCP-3 and NtCP-4 were identical （1-20）， and the signal region of NtCP-5 was 1 ～ 29.

Key words： tobacco； cysteine protease； gene sequence； protein sequence

半胱氨酸蛋白酶是一种多功能的水解类蛋白酶，增加植物体抗性[1-4]，参与细胞衰老和死亡[5-6]，调节蛋白含量[7-8]；半胱氨酸蛋白酶的催化位点主要包括半胱氨酸和谷氨酰胺[9-10]；烟叶在烘烤期间，即变黄和定色期阶段，促使烟叶变黄和大分子物质充分降解[11]，而该生理反应，均受到水分含量的影响，一定程度的水分胁迫，有利于缩短烟叶变黄时间，且促进大分子物质降解[12-13]。然而，半胱氨酸蛋白酶参与植物在水分胁迫时的生理反应，降解受损的蛋白[14]，即半胱氨酸蛋白酶可能参与烟叶在烘烤期间的生化反应。目前，关于深入研究半胱氨酸蛋白酶特性，主要采用生物信息学的方式进行分析，如辐射松、西瓜、水稻等[15-17]，而烟草主要从其蛋白序列的方面进行分析[18-19]，较为单一，为此笔者从半胱氨酸的基因和蛋白序列进行分析，为烟叶半胱氨酸蛋白酶的特性研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 筛选烟草半胱氨酸蛋白酶家族成员

运用NCBI[20]数据库，检索并提取烟草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其登录号分别为ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1

和ADV41672.1，并分别对其进行命名NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5[21]。

1.2 试验方法

采用GSDS绘图工具[22]，依据碱基互补关系，构建烟草半胱氨酸蛋白酶的基因结构（外显子、内含子、上游和下游）；为了比较分析NtCP蛋白的序列特征，采用MEME工具[23]进行分析，其序列长为6～50个氨基酸，E期望值（E-value）设定为10；使用SignalP 4.1工具[24]，分析NtCP的信号肽，其D-cutoff值以Matthews的相关系数进行测定。

2 结果与分析

2.1 烟草半胱氨酸蛋白酶的基因结构分析

通过分析NtCP的DNA序列和cDNA序列得出其基因结构，结果如图1所示。NtCP的同源基因有不同的基因结构组成，基因的长度大约在1.5 kb至3.6 kb之间，NtCP基因序列的长度与外显子/内含子的数目没有直接相关关系，根据NtCP的基因结构，可以将其特征归为三大类：第1类基因结构较为复杂，含有7个外显子，且均具有上下游序列，其成员主要为NtCP-1和NtCP-2；第2类基因含有4个外显子，主要成员为NtCP-3和NtCP-4，但NtCP-3无上下游序列，而NtCP-4仅含有下游序列；第3类基因的结构较为简单，其外显子数为3个，且具有上下游序列，该成员为NtCP-5。NtCP基因的结构长度有很大的区别，而且在不同的基因之间，外显子的长度不一样，即使是同一个基因，其所包含的外显子长度也存在差异，NtCP-1和NtCP-2的DNA序列较大，外显子分布较为分散，即翻译时间相对较长，而NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5的序列较小，且外显子分布较为集中，有利于快速翻译。

2.2 烟草半胱氨酸蛋白酶的保守基序分析

通过对NtCP各成员蛋白的保守基序进行分析，结果如图2所示。在NtCP中检测到4个保守基序，将其分别命名为Motif-1～4，主要的保守基序区有3个，它们的排列顺序相对稳定，该保守基序的排列顺序为Motif-1—Motif-2—Motif-4，核心保守基序区（Motif-1—Motif-2—Motif-4）在5个NtCP蛋白中都有存在，且NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均含有Motif-3（NtCP-5除外），表明序列的保守性存在特异性；根据烟草半胱氨酸蛋白酶保守基序的分布，保守基序的核心区都集中在蛋白質的中间区域和C-端，而NtCP序列中所含有的木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶结构域存在的位置与核心保守基序相同，推断NtCP的核心保守基序是Pept_C1；在NtCP序列中，仅Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸（C）和谷氨酰胺（Q）。2.3 烟草半胱氨酸蛋白酶的信号肽分析

从信号肽、原始的剪切位点和综合的剪切位点3个方面对烟草半胱氨酸蛋白酶的信号肽进行分析，结果表明（图3），NtCP-1和NtCP-2在第13位丙氨酸的信号肽值（S）达到最大，分别为0.992和0.990，而原始的剪切位点（C）和综合的剪切位点（Y）的最大分值均处于第23位甘氨酰胺，NtCP-1的值分别为0.609和0.758，NtCP-2的值为0.742和0.835，因此NtCP-1和NtCP-2均具有信号肽，剪切位点处于第22与23位氨基酸之间，信号肽处于第1 ～ 22位的氨基酸，该信号肽的均值分别为0.943和0.939；NtCP-3和NtCP-4的信号肽值于第12位丙氨酸处达到最大，分别为0.983和0.974，原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第21位苯丙氨酸，NtCP-3的值分别为0.868和0.892，NtCP-4的值为0.807和0.848，即NtCP-3和NtCP-4具有信号肽，剪切位点处于第20与21位氨基酸之间，信号肽处于第1 ～ 20位的氨基酸，该信号肽的均值分别为0.912和0.887；NtCP-5的信号肽值于第7位丝氨酸处达到最大（0.958），原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第30位精氨酸，其值分别为0.582和0.691，表明NtCP-5具有信号肽，剪切位点处于第29与30位氨基酸之间， 且信号肽处于第1 ～ 29位的氨基酸，该信号肽的均值为0.844。

3 结论与讨论

通过基因结构分析，NtCP各成员具有的内含子、外显子之间存在差异，主要存在三种类型，N-端和C-端的基因结构相对保守，而中间区域差异较大，进而为烟叶半胱氨酸蛋白酶的功能多样性创造条件；NtCP具有核心保守基序区（Motif-1—Motif-2—Motif-4），Motif-1和Motif-2均含有半胱氨酸和谷氨酰胺，而半胱氨酸和谷氨酰胺为半胱氨酸蛋白酶的催化位点，可推断NtCP催化位点为序列中间，且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶结构域中，即使未与底物结合，仍可保持电离状态，且可能属于papain家族[9-10]；NtCP均含有信号肽，可分泌于特定区域，确保烟草半胱氨酸蛋白酶的功能多样性[25]。

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