吴思湟,姜 巧,陈 翘,孙卫民,彭 亮

(1.广州医科大学金域检验学院,广州 510182;2.广州医科大学附属第二医院检验科,广州 510260; 3.广东三九脑科医院神经重症监护病区,广州 510510；4.广州医科大学附属第五医院检验科，广州 510700)

24 h尿液生化检查可获得反映糖代谢、肾功能、酸碱代谢平衡等指标的检测数据，对于临床疾病的诊断和病情的判断有重要的帮助[1-3]。24 h尿液标本的留取，需收集患者24 h内的全部尿液。由于时间较长，为抑制微生物的生长、防止葡萄糖的分解，以及保持尿液中待测物质的稳定性，通常需要在留取标本时加入防腐剂。

不同项目的检测选用的防腐剂不同，如浓盐酸用于24 h尿液儿茶酚胺、17-羟皮质类固醇和17-酮类固醇、钙、磷等定量测定；冰乙酸适用于24 h尿液醛固酮测定；麝香草酚适用于尿液显微镜检查，尤其是尿液浓缩结核分枝杆菌的检查；而甲苯适用于尿蛋白等生化项目的测定[4-6]。由于肌酐、尿素和蛋白质等指标对于肾功能判断尤为重要，目前检验科常以甲苯作为24 h尿液生化检查的防腐剂。然而甲苯具有许多缺点，如高度易燃、易挥发，有刺激性气味，可经吸入、食入及皮肤接触导致中毒，对患者及检验工作者的健康危害较大。另外，甲苯对生化仪器中的比色杯还具有一定的腐蚀性[7-8]。因此，寻找新的防腐剂替代品是非常有必要的。尼泊金酯系列(主要包括尼泊金甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、庚酯)作为防腐剂多用于食品、医药、化妆等行业[9]。已有少量研究发现，尼泊金乙酯的防腐性能较甲苯好，且对尿液肌酐、尿素、蛋白的测定没有影响[3-4]。由于抑菌效果和毒性等性质受构成R烷基的碳原子数的影响，随着碳原子数的增加，尼泊金酯的抑菌效果越好、毒性越小[10]。而尼泊金丁酯作为防腐剂用于24 h尿液标本生化检测还未见报道，且尼泊金酯系列对于尿液标本离子检测是否有影响也少有资料可查。故本研究拟将尼泊金丁酯作为防腐剂，分析其对24 h尿液标本中病原菌，以及微量总蛋白、葡萄糖、离子(钾、钠、钙、氯、磷)、肌酐和尿素的影响，探讨其作为防腐剂用于部分生化项目测定的可能性。

1 材料与方法

1.1材料 收集门诊或住院部患者的新鲜尿液标本共40份(有菌尿和无菌尿标本各20份)。每份标本分成4组，包括原始标本组、无防腐剂组、甲苯组、尼泊金丁酯组。

1.2仪器与试剂 采用10%尼泊金丁酯乙醇溶液：称取100 mg尼泊金丁酯，加入1 mL无水乙醇中，使其充分溶解。尼泊金丁酯购自Target Mol公司。分析纯甲苯购自天津科密欧化学试剂有限公司。生化项目检测仪器：自动生化仪日立7600。

1.3方法

1.2.1标本处理及生化检测 原始标本组：采用全自动生化仪日立7600检测微量总蛋白、葡萄糖、离子(钾、钠、氯、磷、钙)、肌酐和尿素。无防腐剂组：不添加任何防腐剂。甲苯组：取10 μL甲苯加入1 mL尿液[11]。尼泊金丁酯组：结合文献并进行条件优化，取5 μL 10%尼泊金丁酯乙醇溶液加入1 mL尿液中，终浓度为0.5 g/L[12-14]。无防腐剂组、甲苯组、尼泊金丁酯组标本常温放置24 h后参照原始标本组方法检测。

1.2.2菌量计数 4组尿液标本均取一定量进行梯度稀释(共8梯度：1∶10-1、1∶10-2、1∶10-3、……、1∶10-8)，在血平板上涂布，待尿液干透后，倒置于37 ℃温箱中培养。24 h后观察细菌(或真菌)的有无及生长情况，并进行菌落计数，换算出尿液中的菌含量，并将数据转化为以10为底的对数形式。

2 结 果

2.1尼泊金丁酯对肌酐、尿素、微量总蛋白检测结果的影响 甲苯组、尼泊金丁酯组及无防腐剂组标本放置24 h后与原始标本组比较，肌酐、尿素、微量总蛋白差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

2.2尼泊金丁酯对离子(钾、钠、氯、磷、钙)检测结果的影响 甲苯组、尼泊金丁酯组及无防腐剂组标本放置24 h后与原始标本组比较，钾、钠、氯、磷、钙离子的结果差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、4。

表1 无菌尿液标本肌酐、尿素、微量蛋白检测结果

注：与原始标本组比较，*P>0.05；检测结果以中位数(四分位数间距)表示

表2 有菌尿液标本肌酐、尿素、微量蛋白检测结果

注：与原始标本组比较，*P>0.05；检测结果以中位数(四分位数间距)表示

表3 无菌尿液标本钾、钠、氯、磷、钙离子检测结果

注：与原始标本组比较，*P>0.05

表4 有菌尿液标本钾、钠、氯、磷、钙离子检测结果

注：与原始标本组比较，*P>0.05

2.3尼泊金丁酯对尿液中病原菌的生长及葡萄糖分解的影响 有菌尿液标本加入尼泊金丁酯后，尿液标本中的细菌含量明显低于原始标本组(P<0.05)。甲苯组和无防腐剂组的菌量，与原始标本组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。无菌尿液标本4组均未见明显病原菌生长(数据未展示)。另外，无菌尿液标本中由于葡萄糖未受病原菌的分解，24 h后与原始标本组葡萄糖水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。而有菌尿液标本中，甲苯组及无防腐剂组的尿液放置24 h后，葡萄糖水平较原始标本组均明显降低(P<0.05)；尼泊金丁酯组与原始标本组比较，葡萄糖水平无明显变化(P>0.05)。见表5。

表5 有菌尿液标本菌落计数及有菌、无菌尿液标本中葡萄糖水平检测

注：与原始标本组比较，*P>0.05，#P<0.05；葡萄糖结果以中位数(四分位数间距)表示

3 讨 论

尼泊金酯系列作为防腐剂用于检验的研究目前较少，有研究认为尼泊金乙酯用于尿液标本的防腐具有效果好、无毒性、不易挥发的优越性。尼泊金乙酯比甲苯具有更好的抑菌防腐功效；能够很好地防止尿液中葡萄糖被微生物酵解，同时不会干扰尿液中蛋白质、尿素、肌酐等化学成分的测定[12-13]。尼泊金丁酯的抗菌作用比尼泊金乙酯更强，多作为防腐剂用于食品、化妆品等行业[10,14]。而其在尿液防腐中的作用国内尚未见报道，因此本项目对尼泊金丁酯用于24 h尿液生化标本的防腐效果进行了研究。

本研究显示，尼泊金丁酯组的葡萄糖水平与处理前的原始标本组差异无统计学意义(P>0.05)。而无防腐剂组和甲苯组葡萄糖水平与原始标本组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，表明这两组葡萄糖均有不同程度的分解，主要原因为微生物的消耗、利用。其余生化指标离子(钾、钠、氯、钙、磷)、肌酐、尿素、微量总蛋白，4组结果差异无统计学意义(P>0.05)。防腐作用方面，对于有菌尿液标本，甲苯组、无防腐剂组的菌量与原始标本组差异无统计学意义(P>0.05)，与邓敬仪等[15]的研究结果一致。甲苯作为防腐剂，其原理主要是在标本表面形成一层甲苯薄膜，阻止尿液与空气接触，达到防腐效果。但如果标本本身已存在大量微生物(如尿路感染患者尿标本)，则甲苯对其抑制作用并不明显。而尼泊金丁酯组与处理前的菌量差异有统计学意义(P<0.05)，说明病原菌生长受到明显抑制。

尿液中含有的细菌等微生物会消耗尿液中的葡萄糖，加入防腐剂的作用是抑制尿液中病原菌的生长，从而使葡萄糖不易被分解。尼泊金酯亦称对羟基苯甲酸酯,由于它具有酚羟基结构,所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强。其作用机制是破坏微生物的细胞膜,使细胞内的蛋白质变性,并可抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性。尼泊金酯的抑菌活性主要是分子态起作用,且其分子内的羟基已经酯化,不再电离，所以它在pH 3.0～8.0均有很好的抑菌效果。尿液在平常饮食条件下，尿液pH值为4.6～8.0，平均为6.0，在此环境下，尼泊金丁酯能较好地发挥其防腐性能。值得注意的是，有研究表明尼泊金丁酯对于芽孢杆菌的抑制作用较弱[14]。

有文献指出，对于24 h尿液标本，尿液蛋白、尿素、肌酐和电解质在不加防腐剂的情况下并无明显影响，不同项目检测的标本留取是否需要加入防腐剂，各实验室应结合当地实际情况(地域、气候等)综合考虑，根据实验结果的侧重性及目的性选择更适合的防腐剂[2,15-17]。本研究结果也进一步证实了该结论。尼泊金丁酯作为防腐剂在24 h尿液标本生化检查中，在不影响离子(钾、钠、氯、钙、磷)、 微量总蛋白、肌酐及尿素结果准确性的情况下，对病原菌有较强的抑制能力，可有效防止菌尿标本中葡萄糖的分解，减小该指标检测的误差。需要提出的是，24 h尿液葡萄糖检测在肾功能判断中的价值存在一定局限性。因此，后续研究可进一步观察尼泊金丁酯对24 h尿液其他项目检测的影响。另外，如何促进尼泊金丁酯在尿液标本中的溶解度也值得继续探索。