李婷婷，李 桢，杜 淼，邢亚楠，董焕声，潘庆杰

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 2661091）

绵羊是第1个被驯化的放牧动物，可以给人们提供肉、皮、奶、毛等主要生产和生活材料，发展绵羊产业能够有效提高畜牧业经济效益[1]。除少部分绵羊品种常年发情外，大多数品种为季节性发情，不能全年进行配种，这在一定程度上影响了羊的繁殖效率，因此提升绵羊单产能力对生产效率有至关重要的影响[2]。由于绵羊高繁殖力的遗传力较低，致使其育种进程非常缓慢[3-4]。湖羊是我国选育出的高繁殖力绵羊品种之一。湖羊源于北方的蒙古羊[5-6]，具有性成熟早、繁殖率高、繁殖周期短、早期生长快等优点，母羊的平均产羔率可达到256%，有的甚至可达300%以上，是世界上较稀少的具有高繁殖力的绵羊品种之一。相比湖羊而言，杜泊羊的繁殖力比较低，但杜泊羊胴体肉质好，生长发育速度较快，体重在100日龄时可以达到30～35 kg。在繁殖力方面，初产的杜泊母羊和经产的杜泊母羊繁殖率分别为135.13%和144.44%[7]。研究表明，ADPN（脂联素）基因及PTGS2（前列腺内过氧化物合酶2）基因是影响繁殖性状的2个主要候选基因[8-9]。本实验以湖羊和杜泊羊为研究对象，采用直接测序法对ADPN基因和PTGS2基因进行多态性检测，深入分析基因突变与繁殖力的关系，为进一步完善基因选育在绵羊生产中的应用、提高羊繁殖能力提供理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及采样方法 实验选择有1～3胎的产羔记录、身体健康的65只湖羊和60只杜泊羊，在山东省朝阳畜牧有限公司同一饲喂条件下自由采食和饮水。在每只羊的耳缘部用75%酒精棉球消毒后，用耳标钳取耳组织1～2 cm，置于盛有无水乙醇的1.5 mL的离心管中，并在每个离心管上标上耳号，放入液氮中带回实验室，-80 保存。

1.2 主要耗材、试剂 细胞/血液/组织基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒由天根生化科技（北京）有限公司提供；DNA Marker、6×Loading Buffer、Premix Taq均购自 TaKaRa公司；核酸染料购自上海生工生物工程公司；无水乙醇，50×TAE缓冲液，琼脂糖。

1.3 基因组DNA的提取 采用细胞/血液/组织基因组DNA提取试剂盒进行湖羊和杜泊羊的耳组织基因组DNA的提取。

1.4 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳 利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度，核酸分析仪测定DNA浓度，DNA OD260/OD280均在1.7～1.9。

1.5 引物设计及PCR扩增与检测 以牛ADPN基因序列为参照[10]，使用Primmer5.0设计ADPN基因引物，扩增ADPN基因第3外显子部分序列；根据Gladney等[11]提供的牛第3外显子到第5外显子的引物作为羊的PTGS2基因引物。引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。

1.6 PCR扩增体系的建立 PCR扩增体系25 µL：上、下游引物各 1 µL；DNA 模板 1 µL；Premix Taq酶 12.5 µL；超纯水 9.5 µL。ADPN基因引物的最佳PCR反应程序：95 预变性3 min，95 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸1 min，35个循环，72 延伸10 min，4 保存。PTGS2基因引物的最佳PCR反应程序：95 预变性3 min，95 变性30 s，53 退火30 s，72 延伸1 min，35个循环，72 延伸10 min，4保存。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 PCR产物的切胶回收 使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR扩增产物切胶回收纯化，DNA溶液直接送去测序。

对ADPN、PTGS2基因进行PCR扩增切胶直接测序，对测得的序列用Megalign软件进行序列比对，并用Blast软件与NCBⅠ上的原始序列进行比对。

1.8 统计分析 运用Excel 2010 软件统计各绵羊ADPN、PTGS2基因位点的突变数、基因型及产羔数，数据以平均值±标准误表示。用SPSS 22.0 软件中一般线性模型完成湖羊、杜泊羊基因型与产羔表型数据关联分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果 从图1中可以看到，条带清晰，亮度较高，无拖尾现象，说明基因组DNA纯度比较好，提取过程没有蛋白质污染，没有DNA降解，所提取的DNA符合后续的PCR扩增要求。

图1 湖羊和杜泊羊DNA检测结果

2.2 PCR扩增产物的检测 如图2显示，湖羊和杜泊羊ADPN基因引物和PTGS2基因引物PCR产物的目的条带明亮并且整齐一致，扩增片段的大小正确，特异性较好，可以用来进行后续实验。ADPN、PTGS2基因的目的片段分别是659、1 600 bp。

2.3 基因纯化 除去PCR产物中的蛋白质及其他有机化合物、无机盐离子、寡核苷酸引物等杂质，提纯后的PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以用来直接测序（图3）。

2.4 突变位点的检测

2.4.1ADPN基因碱基突变的检测 如图4～7所示（为保证突变清洗，截取部分序列长度），ADPN基因在133 bp处发生G→A的突变，该位点的密码子由GAT转变成AAT，并使编码的氨基酸由D（天冬氨酸）转变成N（天冬酰胺）；在594 bp处也发生G→A的突变，该位点的密码子由AGA转变为AAA，编码的氨基酸由R（精氨酸）转变为K（赖氨酸）。

表1 引物序列

图2 ADPN、PTGS2基因PCR检测结果

图3 ADPN 、PTGS2基因纯化结果

图4 ADPN基因在133 bp处的碱基突变

图5 ADPN基因133bp处的峰图

图6 ADPN基因在594 bp处的碱基突变

图7 ADPN基因594 bp处的峰图

2.4.2PTGS2基因碱基突变的检测 如图8、9所示，PTGS2基因在77 bp处发生遗传变异，该位点的密码子由AAA转变为CAA，并使编码的氨基酸由K（赖氨酸）转变为Q（谷氨酰胺）。

图8 PTGS2基因在77 bp的碱基突变

图9 PTGS2基因77 bp处的峰图

2.5 基因突变对产羔数的影响 湖羊1年产羔羊2次或者2年产羔羊3次，母羊平均的产羔率可达256%；与湖羊相比，杜泊羊的平均产羔率为140%。如表2显示，湖羊ADPN、PTGS2基因突变数均极显著高于杜泊羊（P＜0.01）；湖羊平均产羔数极显著高于杜泊羊（P＜0.01）。

表2 基因突变对产羔数的影响

2.6 相关性分析 由表3可以看出，ADPN基因和PTGS2基因的突变与产羔数呈现极显著相关（P＜0.01），说明相关系数的值不是偶然因素造成的；而ADPN基因和PTGS2基因Pearson相关系数值都大于0，说明这2个基因的突变与产羔数之间存在高度的线性正相关。

表3 ADPN、PTGS2基因与产羔数的相关性（n=125）

3 讨 论

ADPN基因在生殖过程中通过不同水平表达来调控下丘脑和垂体、卵巢或者直接作用卵母细胞和胚胎以及雄性睾丸等。刘重旭等[12]在研究中国西南9个山羊品种发现，3´UTR区发生G→A突变，在不同的山羊品种中等位基因的频率不相同。本研究在ADPN基因外显子3共检测到2个突变。杨彦杰等[13]对于牛的研究显示，ADPN基因外显子上检测到1个突变位点，由于牛、羊在生物分类学上归入偶蹄目牛科，均为反刍类食草动物，由此说明牛和羊在进化进程中虽然共祖，但又产生了基因遗传的差异性。本研究在内含子上没有发现碱基突变，这与曹海洋[10]在小尾寒羊上检测到内含子中4个突变不相符，可能是绵羊品种间存在个体差异性。

Liu等[14]和Sirois[15]研究发现，PTGS2的表达调控决定着反刍类食草动物排卵进程的长短。研究发现，PTGS2基因缺陷型的小鼠卵泡正常发育，但因黄体缺乏而导致不能正常排卵[16]。Linville等[17]发现，将野生型胚泡植入到PTGS2缺陷型小鼠子宫内，往往不能发育，进一步证实了PTGS2基因对蜕膜的重要性。本实验在湖羊的碱基序列上检测到1处突变位点，这与梁瑞圆等[18]发现小尾寒羊上PTGS2基因扩增片段中均存在碱基突变的结果一致。

与杜泊羊相比，湖羊高繁殖力的特征较为显著。在本研究中，高繁殖力的湖羊群体在ADPN基因和PTGS2基因都有突变位点，而在杜泊羊群体中没有发现突变位点。湖羊在ADPN基因133 bp处发生G→A突变，并使编码的氨基酸由D（天冬氨酸）转变成N（天冬酰胺）；在594 bp处也发生了G→A突变，编码的氨基酸由R（精氨酸）转变为K（赖氨酸）。在PTGS2基因77 bp处发生了A→C突变，并使编码的氨基酸由K（赖氨酸）转变为Q（谷氨酰胺）。同时，通过相关性分析发现，基因的突变率与产羔数呈显著相关，研究结果证明ADPN基因与PTGS2基因参与调控绵羊的繁殖效率。

4 结 论

本研究发现，ADPN基因与PTGS2基因突变与产羔数呈显著相关，进一步分析发现2个基因是影响湖羊高繁殖力的基因，可以作为高繁多胎性状的候选基因。