● 黄伟锋 卢春敬 许光辉

食管癌主要有两种类型，即鳞状细胞癌和腺癌。在我国，90%以上为鳞状细胞癌，而国外腺癌占比较多，是消化系统常见的恶性实体瘤。它是我国癌症死亡的第四大原因，也是世界十大癌症之一[1]。

目前肿瘤化疗存在的两个主要问题是化疗的副作用和多重耐药性的发展，因此，最小化副作用和最大化功效已成为开发新的抗肿瘤药物的主要目标。中药最近被认为是开发抗癌药物的新来源，并作为一种新的化疗佐剂来提高疗效或改善目前癌症化疗的副作用。近年来研究发现，许多中药的有效成分能在肿瘤细胞周期的某一阶段发生作用，从而阻滞细胞增殖，或(和)诱导细胞凋亡[2]，进而发挥良好的抗肿瘤作用，而对正常细胞无毒副作用。汉黄芩素(5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮，wogonin)是一种黄酮类化合物，研究发现，其对多种肿瘤有抑制作用，包括多发性骨髓瘤[3]、肺腺癌[4]、胶质瘤[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]等。其抗肿瘤分子机制包括：上调细胞内ROS水平，下调PI3K-AKT信号通路，调节MAPKs，上调p53，抑制NF-κB信号通路，抑制GSK-3β活化以及ΔNp63的表达等[9]。本实验主要研究汉黄芩素抑制食管癌细胞生长的机制，为汉黄芩素应用于临床抗肿瘤提供理论依据。

1 材料和方法

1.1细胞培养人食管鳞状细胞癌细胞株KYSE150，购自凯基生物(ATCC；Rockville，MD，USA)，培养于含有10%热灭活胎牛血清(Gibco by Life Technologies，Carlsbad，CA，美国)的RPMI 1640培养基中，培养箱条件控制为37°C，95%空气/5%CO2，95%湿度。

1.2细胞增殖实验收集处于对数期生长的KYSE150细胞，种植于96孔板中，每孔大约5×103细胞(为了减少液体蒸发，培养板周边的孔用PBS填充)，培养箱培养3h使细胞贴壁。用不同浓度的汉黄芩素处理细胞(汉黄芩素溶解于DMSO，DMSO终浓度小于0.1%)，每个浓度的药物设3个复孔。培养48h后，每孔加入20μL Cell Titer 96 AQ One Solution Reagent(Promega，Madison，WI，USA)，继续培养2h。酶标仪(MD SpectraMax M3，CA，USA)测量各孔的OD490nm和OD 650nm吸光值，实验至少重复三次。

1.3细胞周期实验收集不同浓度汉黄芩素处理的KYSE150细胞和空白对照组细胞，大约每组1×106个细胞。参考细胞周期检测试剂盒说明(Keygen Biotech，Nanjing，China)，将体积分数为70%冷乙醇500μL加入到细胞中，固定细胞2小时至过夜，放置于4℃冰箱保存，染色前用PBS将固定液洗去，加入100μlRNase A 37℃水浴30min。最后加入400μL PI染色混匀，4℃避光 30 min，上机检测，流式细胞仪记录激发波长488 nm处红色荧光(BD Accuri C6，Ann Arbor，MI，USA)。用FlowJo software软件分析细胞周期。

1.4细胞凋亡实验收集不同浓度汉黄芩素处理的KYSE150细胞和空白对照组细胞，大约每组1×106个细胞。参考细胞凋亡检测试剂盒(Keygen Biotech，Nanjing，China)，加入5μL Annexin V-FITC 混合均匀后，加入5μL Propidium Iodide混匀，室温、避光、令其反5～15min，流式细胞仪上机检测，记录激发波长488nm处的FL1和FL3。

2 结果

2.1汉黄芩素对KYSE150细胞生长的影响细胞增殖实验表明，汉黄芩素处理KYSE150细胞48h后，细胞的生长受到抑制，且随着药物浓度的增大，其抑制生长作用越大。汉黄芩素大于25μM的实验组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)，汉黄芩素10μM组的抑制作用与对照组相比无统计学差异(P>0.05)(表1)。汉黄芩素作用48h的IC50=(68.59±3.43)μM。

表1 汉黄芩素对KYSE150细胞生长的抑制作用

注：P值为加药组与对照组(Control)相比

2.2汉黄芩素对KYSE150细胞周期的影响为了研究汉黄芩素抑制KYSE150细胞生长的作用机制，笔者进行了细胞周期实验。实验结果表明汉黄芩素作用于KYSE150细胞48h后，可以显著抑制KYSE150细胞增殖，表现为细胞周期G0/G1期所占的比例显著增加，而G2期细胞数显著降低。另外，高浓度的汉黄芩素(100μM)能够显著增加亚G1期(凋亡细胞)的细胞比例(图1、图2)。

图1 汉黄芩素作用48h后KYSE150细胞周期的变化

注：A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

图2 汉黄芩素作用48h后KYSE150细胞周期的变化柱状图

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3汉黄芩素对KYSE150细胞凋亡的影响在研究细胞周期实验中笔者发现高浓度的汉黄芩素可以增加亚G1期(凋亡细胞)的细胞比例，为了进一步研究汉黄芩素对KYSE150细胞凋亡的影响，笔者利用流式细胞技术进行了细胞凋亡实验。实验结果表明，汉黄芩素干预48h后，汉黄芩素50、100μM组的细胞早期凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)，且汉黄芩素的浓度越高，细胞凋亡率也越高，有明显的剂量依赖关系(图3，图4)。

图3 汉黄芩素作用48h后KYSE150细胞凋亡分析

注：X轴代表AV-FITC染色，Y轴代表PI染色。LR和UR区域的百分比分别代表AV阳性/PI阴性(早期凋亡)和AV阳性/PI阳性细胞(晚期凋亡)。A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

图4 汉黄芩素作用48h后KYSE150细胞凋亡分析柱状图

注：与对照组比较，*P<0.05

3 讨论

恶性肿瘤作为全球较大的疾病之一，严重危害人类的健康，是新世纪人类健康的第一杀手。当今世界，随着经济的发展、生活节奏的加快、不良的生活方式以及环境的污染等问题，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势[10]。中药学是我国医药事业的伟大传承之一，汉黄芩素(5，7-二羟基-8-甲氧基黄烷酮)是从黄芩(唇形科)中提取的天然黄酮类化合物，在体外和体内具有特别有效的抗肿瘤活性。有趣的是，汉黄芩素对正常细胞或组织没有毒性或轻微毒性[11，12]。由于其对肿瘤细胞系的选择性毒性，汉黄芩素成为一种有吸引力的候选药物，是一种潜在的新型抗肿瘤药物。

本次实验研究了中药单体汉黄芩素对食管癌KYSE150细胞生存的影响，并对其可能的机制进行初步探讨。汉黄芩素对KYSE150细胞的生长有明显的抑制作用，并有剂量依赖性，与杨莉[13]对汉黄芩素抗肿瘤作用研究进展的报告中关于汉黄芩素能呈剂量、时间依赖性地抑制细胞增殖的观点相符合。细胞周期检测表明，汉黄芩素能使KYSE150细胞发生G1期阻滞，从而表明干扰细胞周期进程是汉黄芩素影响肿瘤细胞增殖的机制之一。另外，流式细胞术检测细胞凋亡显示，随着汉黄芩素剂量的增大，凋亡细胞比例变大。芦曦[7]等研究汉黄芩素对SGC7901细胞增殖和侵袭活性的影响，发现汉黄芩素对SGC7901细胞生长有明显抑制作用，其抑制细胞生长的IC50为(74.26±1.21)μM，与本实验得出的IC50=(68.59±3.43)μM相近。本实验结果表明汉黄芩素作用48h后，影响肿瘤细胞周期分布，使S期、G2/M期细胞比例减少，G0/G1期细胞比例增大，表明汉黄芩素将肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制细胞增殖。在个体发育过程中细胞的凋亡受基因调控，是一种细胞自杀活动。恶性肿瘤的生物学特征包括细胞增殖过度、细胞凋亡受阻，研究表明汉黄芩素的抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关[9]。许多文献表明，汉黄芩素诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与调节细胞凋亡相关基因的表达有关，例如Bcl-2、p53、survivin等[14]。

综上所述，汉黄芩素能够抑制食管癌SGC7901细胞的生长，其机制可能是通过阻滞细胞周期进程和诱导细胞凋亡。这为汉黄芩素将来用于治疗食管癌提供理论依据。