金黎明，李春斌，权春善，侯熙彦，赵 晶，胡文忠

(1.生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116605；2.大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605)

满药复方木鸡颗粒来源于满族医药中治疗肝病的传统偏方“木鸡汤”，由木鸡(即云芝)和核桃楸皮两味药物组成，在原有药物基础上加入了具有扶正袪邪功效的山豆根、菟丝子，形成了现在的复方制剂，其中核桃楸皮为首次入药的民族药物[1-2]。经过30多年的临床应用证明，该复方对慢性乙型病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝腹水等各种肝病具有很好的治疗效果，是目前国内唯一的肝癌前期阻断治疗药物，具有显著的预防和治疗肝癌作用[3-6]。

近年来，研究者对复方木鸡颗粒对除肝癌细胞外的其他多种癌症细胞的作用进行了研究，结果表明，其对人宫颈癌细胞株(Hela)、人肺腺癌细胞株(A549)、人急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)、红白血病细胞株(K562)和人Burkitt淋巴瘤细胞株(Raji)等都有一定抑制生长、诱导凋亡的作用[7]；对不同p53野生基因型的人结肠癌细胞(SW620p53mt、SW480p53mt、 HCT116p53wt)有明显的抑制生长作用[8]；对艾氏腹水癌细胞有直接杀伤作用[9]。此外，对肝癌外的其他晚期恶性肿瘤都有一定的疗效[10]。提示了复方木鸡颗粒除防治肝病外，可能具有其他药理作用。

本实验研究了复方木鸡颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5种致病菌的抑菌活性，以及对结肠癌细胞HT-29的抑制作用，为满药复方木鸡颗粒功能的研究进一步补充了数据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 药物

复方木鸡颗粒，辽宁丹东药业有限公司提供。

1.1.2 菌株、细胞与试剂

指示菌：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌和白色念珠菌为实验室保藏菌。

结肠癌细胞HT-29，购自中国科学院细胞库。

LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH约为7.0。

试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑盐(MTT)，购于GIBCO公司。

1.1.3 仪器

SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；MT-180B生化恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；ZWY-A2102C双层可编程恒温摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；HERAcell150I二氧化碳培养箱(美国BTX)；LOGIC4 A2生物安全柜(美国LABCONCO)；SYNERGYH1多功能酶标仪(美国BIOTEK)。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌活性测定

采用琼脂平板打孔法测试复方木鸡颗粒的抗菌活性[11]。

用去离子水溶解复方木鸡颗粒，在80 ℃水浴锅中加热30 min(灭菌并使药品完全溶解)，将制备好的药剂样品在超净工作台中用连续10倍稀释的方法，配制0.200、0.020、0.002 mg·mL-1三个不同质量浓度，待用。

LB培养基融化后，室温放置至40 ℃左右，接入供试菌种，倒平板，待培养基凝固后，用打孔器在平板内的培养基上打4个孔，分别注入3个质量浓度(0.200、0.020、0.002 mg·mL-1)的复方木鸡颗粒溶液各200 μL，对照孔加入200 μL去离子水。

将培养皿放入培养箱内，37 ℃条件下培养12 h，观察抑菌圈的大小并测量抑菌圈的直径，做好记录。每个样品重复3次，对所得结果进行分析。

1.2.2 体外抗肿瘤活性检测

应用MTT法检测复方木鸡颗粒对结肠癌细胞HT-29生长的抑制作用。将复方木鸡颗粒用超纯水溶解，配制成0.2 mg·mL-1，微孔滤膜过滤除菌待用。取对数生长期的结肠癌细胞HT-29，以2×104个·mL-1密度接种于96孔培养板中，加入样品溶液100 μL，37 ℃，5% CO2条件下分别继续培养12、24、48、72 h，空白对照组加入DMSO(使DMSO终浓度为0.03%)，每组重复3个复孔。于培养结束前4 h，每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，继续培养。终止培养后，1 000 r·min-1离心10 min，吸取并弃掉培养液，在每孔中加入100 μL DMSO，震动10 min，使结晶物充分溶解，用自动酶标仪测定570 nm波长下各孔的吸光度(A)，将A值作为反映结肠癌细胞HT-29的细胞活性及代谢状况的参数[12]。

生长抑制率计算公式为

(1)

2 结果与讨论

2.1 抗菌活性测定结果

用琼脂平板打孔法研究复方木鸡颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5种致病菌的抑菌活性，测定结果见表1。效果图如图1，其中1：对照，去离子水；2：0.002 mg·mL-1样品；3：0.020 mg·mL-1样品；4：0.200 mg·mL-1样品。

表1 抑菌活性测定结果

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)白色念珠菌

复方木鸡颗粒对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，质量浓度为0.200 mg·mL-1的样品对三种菌的抑菌圈分别为(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm；而在这三种浓度下，对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌都没有显示出抑制活性。

2.2 抗肿瘤活性测定结果

复方木鸡颗粒对结肠癌细胞HT-29的生长抑制率如图2。复方木鸡颗粒对结肠癌细胞HT-29具有较明显的抑制作用，随着培养时间的增加，生长抑制率越来越高，培养72 h后，生长抑制率达到85.52%。

图2 对结肠癌细胞HT-29的生长抑制率

复方木鸡颗粒对结肠癌细胞HT-29培养72 h的生长抑制活性图3。

(a)对照组 (b)实验组

3 结 论

本实验用琼脂平板打孔法研究了满药复方木鸡颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5种致病菌的抑菌性能。结果表明，复方木鸡颗粒对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，0.2 mg·mL-1的样品对三种菌的抑菌圈分别为(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm。此外，复方木鸡颗粒对结肠癌细胞HT-29有较明显的抑制作用，培养72 h后，生长抑制率达到85.52%。

近年来，国内对民族药的研究有升温趋势，但目前多集中在藏药、蒙药、苗药等民族药，对满药的研究尚不多见，亦没有形成规模体系。复方木鸡颗粒作为最著名的传统满药之一，仍具有很大的研究价值和开发空间[1]。关于复方木鸡颗粒的前期研究多集中在肝病治疗方面，而本实验研究了复方木鸡颗粒的抑菌作用以及对结肠癌细胞HT-29的抑制作用，为复方木鸡颗粒功能的进一步研究提供了数据。