陈奕彤，张斯然，张春波，金东日

(延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，化学系，吉林 延吉 133002)

蛋白质的糖基化是真核细胞中最常见的翻译后修饰，对蛋白质的折叠、定位及运输有重要作用[1-4]。作为糖基化修饰的主要类型之一，天冬酰胺(Asn)残基上的N-糖基化发挥着重要的生物学功能，如参与细胞黏附、蛋白质折叠和信号转导等生命过程[4]。人类许多疾病的发生和发展均与N-糖链结构和表达量的改变有关[5-6]。因此，建立糖蛋白中N-糖链的分析方法对寻求疾病中有效的生物信息具有重要的现实意义。

糖蛋白N-糖链的常用分析过程为：首先用蛋白酶(如N-糖苷酶F)释放糖蛋白的糖链，获得糖链与蛋白混合物，然后对糖链进行富集纯化，最后对其结构进行分析。生物质谱可对各种糖链进行结构分析，是解决糖链结构的有效手段。糖链结构研究中，采用电喷雾离子化-质谱(ESI-MS)技术无需衍生化即能确定糖链的组成和结构，但易受样品盒溶剂中干扰物的影响，因此需进行繁琐的糖链分离、纯化处理。常用的糖链富集纯化方法有凝集素亲合法、石墨碳柱固相萃取法等。凝集素亲合法可以捕获不同的糖链，但凝集素不能吸附所有类型的糖链。石墨碳柱存在操作繁琐、重现性差、样品损失大、成本高等缺陷。近年来，在线分析技术的发展使得联用技术日趋完善，如气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)和毛细管电泳-质谱(CE-MS)等联用技术无需过多的分离纯化步骤，可直接将微量样品上样分析，更加有效地获得相关的糖链结构信息。但这些方法存在由于糖链本身不易质子化、检测灵敏度低和很难获得糖蛋白糖链表达量改变信息等问题。化学衍生化方法是解决上述问题的有效方法之一。通过对糖链的衍生化，可增加糖链的疏水性使之易于在色谱柱上保留，提高糖链的质谱灵敏度，还可以进行糖链的相对定量分析[7-9]。但需要在实验过程中进行额外的化学反应，这不仅需要引入试剂，增加反应步骤，还会产生副反应。

前期研究中，本课题组合成了带1个GlcNAc的同位素标记受体(如PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc等)[9]。本研究利用Endo-M N175Q能将天然糖肽(如SGP)中糖链转移到糖链受体上的特性，以PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc为糖链受体，建立了新的糖蛋白糖链分析方法，并将此方法应用于糖蛋白N-糖链的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260 HPLC系统联用6460三重四极杆质谱(美国Agilent Technologies)；HB-100恒温金属浴(杭州大和热电子有限公司)；FD-LD-50低温冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司)；H-1650电动离心机(长沙湘林离心机仪器有限公司)。

DL-二流苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基甲烷、盐酸胍、甲酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲酸(色谱纯)、乙二胺四乙酸二钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵购自北京百灵威科技有限公司；胎球蛋白(Fetuin)、胰核糖核酸酶B(RNase B)购自Sigma-Aldrich 公司；N-糖苷酶F(PNGase F)购自NEW ENGLAND Biolabs Inc；丙酮、乙腈等均为色谱纯。d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc按文献合成[13]。

1.2 糖蛋白水解

取 3 mg 糖蛋白样品(牛胰核糖核酸酶B、卵清蛋白、胎球蛋白) 溶于50 μL pH 8.5的Tris-HCl(含7 mol/L盐酸胍和5 mmol/L EDTA)缓冲溶液中，加100 μL 1 mol/L DTT，65 ℃下反应30 min，冷却至室温，加140 μL 0.5 mol/L IAA，室温下反应40 min，加 60 μL 1 mol/L DTT终止反应。

将上一步变性后的反应液过PD Mini G-25凝胶柱，除去盐类等小分子物质。用1 mL缓冲液洗脱，收集洗脱液并冷冻干燥8 h后，将样品溶于50 μL pH 8.0碳酸氢铵缓冲液中，加胰蛋白酶10 μL(0.1 mg)，充分混合2 min，于37 ℃金属浴中恒温避光反应20 h。

1.3 糖肽及SGP富集

向得到的酶解液中加入300 μL丙酮，于-25 ℃冰柜中放置至少16 h，然后以12 000 g离心15 min，立刻移除上清液，沉淀以氮气吹干，得到糖肽。

分别取50 μL 4 mmol/L SGP溶液于3个2 mL离心管中，依次加入150、250、350 μL冷丙酮。于-25 ℃冰柜中放置20 h后，以12 000 g离心10 min，移除上清液，将底部沉淀用氮气吹干。3个离心管中分别加入50 μL 流动相溶解样品，用LC-MS进行检测。

1.4 Endo-M N175Q糖链转移反应

向用20 μL pH 6.5磷酸钠缓冲液溶解的糖肽中加5 μL 1 mol/L d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(或d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc)和 5 mU 5 μL Endo-M N175Q，在32 ℃金属浴中进行4 h酶促反应。反应结束后，加10 μL乙腈使酶失活，取2 μL反应液进行LC-MS分析。

1.5 LC-MS条件

色谱柱为YMC色谱柱(2.0 mm×150 mm，3 μm)；流动相：A为10 mmol/L 甲酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～18 min,5%～53%B；18～28 min,53%B；28～33 min,53%～95%B；33～36 min,95%～5%B；36～45 min,5%B。流速为 0.2 mL/min，进样量为2 μL。

离子化条件：ESI电离源，正离子扫描，喷雾电压 4 kV，雾化气20 psi(1 psi≈6.9 kPa)，加热气30 psi，气帘气 25 psi，干燥气流速10 L/min，干燥气温度350 ℃，四极杆温度100 ℃，停留时间100 μs。全扫描模式，扫描范围m/z100～1 200。数据处理软件为Mass Hunter工作站B.06.06版软件。

2 结果与讨论

2.1 Endo-M N175Q酶促反应标记N-糖链

采用在前期研究中合成的易质子化，且带1个GlcNAc的糖基受体PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc[9]，以PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc和糖肽(如SGP)作为酶催化反应的底物时，Endo-M N175Q酶促反应可促使糖肽上的糖链释放，并将其转移至PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，得到糖链标记物，从而增加了糖链的疏水性，便于色谱分析，并提高糖链的MS检测灵敏度(图1)。

2.2 丙酮加入量的选择

糖肽和肽有微小的极性差异，糖肽的亲水性强于一般的肽段。当糖肽和肽的混合溶液中加入非极性溶剂时，极性大的糖肽会发生沉淀，而极性小的肽溶于非极性溶剂中，如Kawasaki等[14]用丙酮沉淀经胰蛋白水解的α1-酸性糖蛋白(αAGP)酶解液中的糖肽，结果有90%以上的糖肽富集在沉淀中。由于酶解液中丙酮的加入量对糖肽富集效果至关重要，本实验以唾液酸糖肽(SGP)为糖肽模型，分别考察了丙酮体积为样品体积的3、5、7倍时糖肽的富集效果。结果显示，当丙酮体积为样品的5倍时，沉淀中检测到的SGP的峰面积最大，因此选择丙酮加入量为样品体积的5倍。

2.3 糖蛋白N-糖链分析

2.3.1核糖核酸酶B以RNase B作为糖蛋白模型进行胰蛋白酶解、丙酮沉淀糖肽。以富集分离得到的糖肽和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc为酶促反应底物，进行Endo-M N175Q酶转糖基反应，得到N-糖链标记物并进行LC-MS检测。为考察丙酮富集糖肽方法对糖蛋白N-糖链的检测情况，以未经丙酮处理的RNase B酶解液进行糖链转移反应，仅检测到M5N2和M6N2 ，而经丙酮富集后的样品(图2)中可检测到高甘露糖型糖链M5N2、M6N2、M7N2、M8N2和M9N2(M：甘露糖; N:N-乙酰葡糖胺)。每种糖链均以[M+2H]2+形式检出，表明丙酮能够有效沉淀糖肽和肽混合溶液中的糖肽，从而可避免大量存在的肽对N-糖链检测的干扰。进一步根据每种糖链的质谱峰面积对糖链进行相对定量分析，将M5N2丰度设为100%，5种高甘露糖型糖链M5N2、M6N2、M7N2、M8N2和M9N2的相对丰度依次为100%、95.94%、21.31%、15.9%、4.65%，实验结果与文献报道基本一致[15]。

图1 以SGP(糖基供体)和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(糖基受体)为酶催化反应底物的Endo-M N175Q酶糖链转移反应Fig.1 Reaction scheme for transglycosylation reaction between SGP(a donor) and PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc( an acceptor) with Endo-M N175Q

图2 RNase B的Endo-M N175Q酶促反应产物N-糖链标记物的EIC色谱图(A)与MS图(B)Fig.2 EIC chromatograms(A) and MS spectra(B) obtained from the transglycosylation reaction of glycans in RNase B with Endo-M N175Q and d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAcM:mannose; N:N-acetylgluosamine

2.3.2牛胎球蛋白牛胎球蛋白是一种α糖蛋白，分子量为48.4 kDa，含有1条由341个氨基酸组成的肽链，N-糖基化位点在81、138和158 Asn位上，N-糖链含有二天线和三天线结构。胎球蛋白N-糖链标记物的LC-MS检测结果见图3。从提取离子色谱图中可清晰地检测到5条糖链M3N4G2Ac2、M3N4G2Ac3、M3N5G3Ac、M3N5G3Ac2、M3N6G4Ac4(G：半乳糖; Ac:N-乙酰神经氨酸)，并经MS确认。M3N4G2Ac2以[M+2H]2+形式检测；M3N4G2Ac3、M3N5G3Ac2、M3N6G4Ac4以[M+3H]3+形式检测；M3N5G3Ac检测到[M+2H]2+和[M+3H]3+的分子离子峰。以上结果表明，丙酮能够有效沉淀糖蛋白酶解液中的糖肽，而且这些天然糖肽可作为酶促反应底物，Endo-M N175Q能将糖肽的N-糖链转移到受体上，从而在LC-MS上得到分离和检测。

综上所述，与常用的糖肽富集纯化方法(如凝集亲合法、石墨碳柱固相萃取法)相比，利用丙酮富集糖肽方法操作简便、成本低、样品损失少，同时能够有效富集多种类型的糖肽。通过标记糖链上易质子化的基团，不仅可有效分离糖链，而且提高了糖链的检测灵敏度。另外，本方法利用同位素标记试剂(如d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc)可对糖链进行相对定量分析。

图3 牛胎球蛋白的Endo-M N175Q酶促反应产物N-糖链标记物的EIC色谱图(A)与MS图(B)Fig.3 EIC chromatograms(A) and MS spectra(B) obtained from the transglycosylation reaction of glycopeptides in bovine fetuin with Endo-M N175Q and d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAcM:mannose; N:N-acetylgluosamine; G:galactose; Ac:N-acetylneuraminic acid

3 结 论

本文首次利用丙酮富集技术和Endo-M N175Q转糖基活性，建立了新的糖蛋白/糖肽N-糖链的分析方法。该方法较为简便，可在温和的条件下将带特定基团(如易质子化，同位素标记)的标签和糖肽的寡糖链直接连接，从而得到较好的糖链色谱分离和高灵敏质谱检测，可进行糖链的相对定量分析。