李程 张境 王勇翔

200032上海,复旦大学基础医学院病原生物学系医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范围的健康问题。据估计全球约有2.5亿人罹患慢性乙型肝炎[1]。目前治疗慢性乙肝的抗病毒药物有干扰素α、PEG化干扰素α和核(苷)酸类似物等[2]。干扰素治疗具有明显的副作用；核苷酸类似物治疗因停药后出现病毒复制反弹而需长期用药，有病毒耐药的风险[3]。因此，迫切需要开发新的抗HBV制剂。

HBV通过结合钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP)受体进入肝细胞，核衣壳被运输到细胞核。在细胞核内，核衣壳内的松弛环状 DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)被修复成共价闭合环状DNA(covalently closed circular，cccDNA)。 以cccDNA为模板，细胞RNA聚合酶II转录出5种HBV RNA，包括3.5 Kb编码HBe抗原前体的precore RNA和编码核心蛋白和聚合酶的前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)、2.4 Kb编码 L蛋白的 mRNA、2.1 Kb编码M和S蛋白的mRNA，0.7 Kb的编码X蛋白的mRNA。HBV聚合酶结合pgRNA5’端茎环结构，同时招募核心蛋白二聚体包裹pgRNA成核衣壳[4]。在核衣壳内，HBV聚合酶以pgRNA为模板逆转录合成负链 DNA后，通过 RNaseH活性将pgRNA/负链DNA双链中的pgRNA降解，再以负链DNA为模板合成正链DNA。核衣壳在多囊泡体出芽并释放出细胞[5]。

NEDD8是与泛素类似的蛋白。NEDD8在其活化酶(NEDD8 activating enzyme， NAE/E1)、结合酶(E2)，连接酶(E3)的催化下，将其羧基端第76位的甘氨酸与底物的赖氨酸共价结合，这一过程叫做NEDDylation。NEDDylation的底物主要是含 cullin的泛素连接酶(cullin-RING liagses，CRLs)[6]，参与调节泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)从而参与调节细胞信号转导、细胞周期、细胞生长及凋亡。近年来研究表明NEDDylation还与病毒复制有关。疱疹病毒、腺病毒和流感病毒通过NEDDylation激活CRLs而促进病毒复制[7-8]；一些RNA病毒(如仙台病毒、水疱性口炎病毒等)通过 CRLs相关的 UPS促进干扰素调节蛋白-3(interferon regulatory factor 3，IRF3)降解而干扰抗病毒先天性免疫反应[9-10]。近年来研究还发现存在不依赖CRLs的NEDDylation[11]，提示NEDD8可能具有额外的生物学功能。目前关于细胞NEDDylation在HBV复制中的作用仍不清楚。本研究采用NAE特异性抑制剂 MLN4924抑制细胞CRLs和其他一些底物的NEDDylation，检测HBV复制和HBV pgRNA包装效率。

1 材料与方法

1.1 材料 pCH-9/3091质粒由德国弗赖堡大学Michael Nassal教授提供，包含D基因型的HBV基因组(GenBank登记号V01460)。为检测包装入核衣壳的pgRNA，本研究构建了HBV聚合酶失活变异体表达质粒pCH-9/3091-YMHD:以pCH-9/3091质粒为基础，将聚合酶催化中心YMDD基序基因突变为YMHD基因而获得HBV聚合酶失活变异体pCH-9/3091-YMHD，将该质粒转染Huh-7细胞后，pgRNA可被包装入核衣壳，但不能合成负链DNA，pgRNA也不被降解，因此核衣壳内的HBV核酸为pgRNA。将 HBV核心蛋白基因扩增后克隆入pCDNA6载体获得pCDNA-core质粒，将该质粒转染Huh-7细胞后，细胞虽然产生了大量核心颗粒，但用HBV特异的探针作杂交发现这些颗粒不包装任何HBV特异的核酸，用作对照。Huh-7细胞和四环素调控且稳定表达HBV的HepAD38细胞为本室保存。MLN4924购自 MedChemExpress公司，胎牛血清购自Gibco公司，DMEM培养液和核酸预杂交液购于ThermoFisher Scientific公司，随机引物DNA标记试剂盒购自Roche公司，α-32P-dGTP购于Perkin-Elmer公司。实验中所用抗体及来源如下:anti-core多克隆抗体(Dako公司)，anti-core单克隆抗体由张继明教授(复旦大学附属华山医院)馈赠，actin单克隆抗体和gpr78多克隆抗体(Proteintech公司)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(Jackson ImmunoResearch公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:Huh-7细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养，每1～2 d进行细胞传代。HepAD38细胞在上述培养基中额外添加200μg/ml G418抗生素，在相同培养条件下生长，不含四环素的培养液培养使pgRNA转录而起始HBV复制，每2～3 d传代。

1.2.2 DNA转染:计数3.0×105个Huh-7细胞铺于6孔板中，18～24 h后进行转染。取250μl opti-MEM，加入质粒 DNA 2.5μg，混匀后加入7.5μl TransIT-LT1转染试剂，混匀后静置15 min。将混合物均匀滴加到已更换新鲜培养液的6孔板中。

1.2.3 药物处理:向HepAD38细胞培养上清中加入梯度浓度的MLN4924，并用不同浓度的HBV聚合酶抑制剂 LAM作对照，每 3 d更换1次含MLN4924或LAM的培养基，加药后第6天用NP40裂解缓冲液裂解细胞；向转染了pCH-9/3091-YMHD的Huh-7细胞中添加MLN4924(终浓度为0.1 μmol/L)，并添加DMSO作为对照(MLN4924溶于DMSO)，每3 d更换1次含MLN4924或DMSO的培养基，加药后第6天裂解细胞。

1.2.4 细胞内病毒核衣壳检测:利用非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis，NAGE)分离HBV核衣壳:NP40裂解液裂解细胞，细胞膜、细胞器膜和HBV包膜破裂，核衣壳释放出来。裂解液经1%的琼脂糖凝胶分离，衣壳颗粒在电场的作用下向正极迁移。随后用免疫印迹检测核衣壳:通过虹吸转膜装置将衣壳颗粒转移至尼龙膜上，5%脱脂奶粉封闭后与anti-core多克隆抗体孵育，TBST漂洗后与 HRP标记的二抗孵育，用化学发光液(chemiluminescence， ECL)检测。

1.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和免疫印迹:细胞样品用含SDS的样品缓冲液处理，100℃变性10 min。配制4.5%浓缩胶和12.5%分离胶进行电泳。电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，按照1.1.3所述方法检测蛋白。

1.2.6 细胞内HBV DNA提取:取一定量细胞裂解上清加入DNase I 37℃消化处理30 min，再加入蛋白酶K 53℃消化释放病毒基因组，最后经酚/氯仿抽提和DNA沉淀获得HBV DNA。

图1 MLN4924剂量依赖地抑制HepAD38细胞HBV DNA复制A.According to the different detection methods， the results were divided into three parts:NAGE， Southern blot and Western blot.HepAD38 Cells were incubated with various concentrations of MLN4924 and lamivudine for 6 days.Intracellular capsids were analyzed by NAGE， capsid associated viral DNAs by Southern blot， and viral and cellular proteins by Western blot；B.Graphic presentation of HBV replication marker levels at the treatment of increasing concentrations of MLN4924Fig.1 MLN4924 inhibited HBV DNA replication in a dose-dependent manner in HepAD38 cells

1.2.7 Southern blot检测病毒 DNA复制:HBV DNA样品经1%的NAGE分离；变性液和中和液分别处理凝胶45 min后，通过虹吸转膜装置将病毒DNA转移至尼龙膜上；尼龙膜80℃烤膜固定；预杂交液42℃孵育30 min；用随机引物DNA标记试剂盒标记探针；将变性后的掺入32P标记的dGTP的DNA探针加入预杂交液中42℃杂交过夜；洗膜后磷屏曝光，最后用多功能生物分子成像仪扫描磷屏记录的信号并成像。

1.2.8 原位检测核衣壳中DNA:1.2.4中经NAGE分离和免疫印迹检测的核衣壳在80℃烤箱中烘烤2 h，使衣壳颗粒固定在尼龙膜上，DNA变性液处理5 min，中和液处理5 min；再用1.2.6所述方法检测颗粒内的病毒DNA。

1.2.9 原位检测核衣壳中RNA:相关溶液均用DEPC水配制，检测方法同1.2.7。

1.2.10 数据处理:利用 FUJIFILM公司的 Multi Gauge V2.2软件对蛋白、DNA及RNA信号进行灰度扫描；利用数据处理软件Origin 8.0进行折线图的绘制；两组数据均数的比较采用Student-t检验，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 MLN4 924剂量依赖地抑制HBV DNA复制Western blot结果显示0.1～20μmol/L LAM和0.01～2μmol/L MLN4924对actin和GRP78蛋白的表达无明显影响(图1A，Western blot)，提示高达20 μmol/L拉米夫定和2μmol/L MLN4924不引起细胞毒性。Western blot检测细胞内核心蛋白，NAGE-免疫印迹检测细胞内核衣壳，结果显示LAM不改变核心蛋白的表达和核衣壳的形成，而MLN4924能轻度剂量依赖地减少核心蛋白和核衣壳(图1A，Western blot和NAGE)。Southern blot和原位病毒DNA检测结果显示LAM和MLN4924都能显著地且剂量依赖地减少核衣壳相关病毒DNA(图1，Southern blot和NAGE)。灰度扫描结果显示，随着MLN4924浓度增高，actin的量无明显变化，核心蛋白和核衣壳变化趋势一致，Southern blot和NAGE原位检测病毒DNA结果一致(图1B，Southern blot和NAGE)，且随着MLN4924浓度增加，核衣壳中病毒DNA下降幅度显著高于核衣壳(图1A，capsid和DNA；图1B)，这提示HBV pgRNA包装或下游DNA合成可能被抑制。

2.2 MLN4924抑制HBV pgRNA包装 pCDNA-core转染Huh-7细胞后，细胞产生了大量核心颗粒(图2A，capsid)，但HBV特异的探针作杂交结果显示颗粒中不包装任何HBV特异的核酸(图2A，pgRNA)。pCH-9/3091-YMHD转染Huh-7细胞后，细胞也产生了大量的核心颗粒(图2A，capsid)，而且这些颗粒包装了pgRNA(图2A，pgRNA)。当用核心颗粒的量作校正后，发现0.1μmol/L MLN4924使核衣壳包装的pgRNA减少至DMSO对照组的53.4%(图2B)，而相同浓度的MLN4924也使衣壳相关病毒 DNA减少至对照组的56.6%(图1B)。因此MLN4924可能通过抑制pgRNA包装而减弱HBV复制。

图2 MLN4924抑制HBV pgRNA的包装A.Huh-7 cells were respectively transfected with pCH-9/3091-YMHD or pCDNA-core plasmids，then incubated with MLN4924 or vehicle-DMSO.Cytoplasmic capsids and capsid-associated RNA were sequentially detected with NAGE-immunoblotting and hybridization with 32 P labeled HBV specific DNA probes；B.Graphic presentation shows that relative pgRNA encapsidation efficiency by normalizing the amount of packaged pgRNA with that of capsids.NS:Not significant， ∗P ＜0.05 Fig.2 MLN4924 inhibited pgRNA encapsidation

3 讨论

本研究采用NAE抑制剂-MLN4924干扰细胞内蛋白NEDDylation修饰反应。MLN4924轻度剂量依赖地抑制核心蛋白的表达。有研究发现NEDDylation修饰HBV X蛋白(HBx)后可阻止HBx通过泛素化途径降解[12]，从而促进cccDNA转录激活[13]。NAE抑制剂MLN4924抑制HBx NEDDy lation，HBx降解增多，其促进cccDNA转录作用减弱，从而导致编码核心蛋白的pgRNA减少。

MLN4 924剂量依赖地减弱pgRNA包装和HBV DNA复制，而且两者下降程度相近。HBV DNA复制是 pgRNA包装入核衣壳的后续步骤，因此MLN4924通过抑制pgRNA包装而减弱HBV DNA复制。pgRNA包装是个复杂的过程。在宿主因子如HSP90等的帮助下，HBV聚合酶识别并结合pgRNA，再招募核心蛋白二聚体组装成核衣壳，如果NEDDylation修饰上述病毒或宿主蛋白，或修饰其他未知宿主因子而调节pgRNA包装，则像MLN4924这样的NEDDylation抑制剂将抑制pgRNA包装。因此，本研究还将检验 HBV聚合酶、核心蛋白和HSP90是否为NEDDylation的底物，这将有助于进一步了解HBV复制机理。

利益冲突 无