陈美意，王逸琦，狄春红，洪 玉，王 靖，金乐红，谭晓华

(1.杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 310036； 2.杭州师范大学附属医院 检验科，浙江 杭州 310015)

砷是自然界广泛存在的一种有毒的类金属元素[1]，是确定的一类致癌物，可导致肝、肺等多种组织的癌症，还与糖尿病、心脑血管疾病等相关[2-3]。研究发现，砷是细颗粒物PM2.5的重要成分[4-5]。砷微核试验是化学毒物或物理因素损伤染色体、干扰细胞有丝分裂的快速检测方法。微核是间期细胞中染色体畸变的一种表现形式，在各种理化因子，如辐射、化学药剂作用下产生的染色单体的无着丝粒断片或因纺锤丝受损而丢失的整个染色体，不能随有丝分裂进入子细胞, 在细胞质中形成一个或几个规则的次核。本研究采用小鼠骨髓微核法检测亚砷酸钠对微核形成的影响，为研究亚砷酸钠(NaAsO2)的遗传毒性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 NaAsO2(美国sigma公司)用生理盐水配制为0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL 各浓度的溶液，环磷酰胺(天津金世制药有限公司)用生理盐水配制浓度为4 mg/mL的溶液。

1.2 小鼠分组及处理 选用昆明种成年小鼠，雌雄小鼠各随机分为6 组，每组8只。采用等容量法灌胃给药，每20 g体重小鼠灌胃0.5 mL药物。以环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)100 mg/kg剂量组为阳性对照，以生理盐水处理组为阴性对照。小鼠经口LD50亚砷酸钠为50 mg/kg[6]，亚砷酸钠处理各组剂量分别为1.5625，3.125，6.25，12.5 mg/kg，共灌胃2次，每次间隔24 h。

1.3 股骨骨髓细胞涂片制备 于第二次灌胃6 h后处死小鼠，剥离股骨，剪除两端骨垢。每只小鼠用0.5 mL胎牛血清冲洗股骨骨髓至离心管中，800 rpm离心5 min收集骨髓细胞。吹匀后用枪头吸取少量骨髓细胞滴至载玻片一端1/3处上，取另一张载玻片边缘置于骨髓细胞上呈30°角，迅速推片，在酒精灯上烤干后将载玻片置于甲醇中固定15 min，晾干后于新鲜配置的吉姆萨染液中染色20 min，取出后清水冲洗掉多余染液并晾干。

1.4 镜检观察计数 油镜下观察计数，嗜多染红细胞(PCE)呈灰蓝色，正染红细胞(NCE)细胞呈橘黄色。计数1000个PCE，计算嗜多染红细胞微核率(micronucleus frequency，MN‰)；计数200个红细胞，计算PCE/NCE比值。选取两名有经验成员进行平行计数，取其平均数，如数值差距较大则转换视野重新计数。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠骨髓PCE微核率的影响 微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小为主核的1/20～1/4(图1)。与生理盐水灌胃的阴性对照组比较，雌、雄性小鼠亚砷酸钠各处理组的骨髓PCE细胞微核率均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；且微核率随着砷浓度的增加而增加，呈剂量依赖效应。雌性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2剂量组微核率为14.02±3.20‰，100 mg/kg CTX阳性对照组的微核率为14.89±0.70‰，差异无统计学意义(P>0.05)；雄性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2组微核率为14.25±0.60‰，100 mg/kg CTX阳性对照组的微核率为15.49±0.80‰，差异无统计学意义(P>0.05)。亚砷酸钠同剂量组间的雌、雄小鼠间微核率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 微核细胞(箭头所示)(×100)

注：A. 雄性小鼠；B. 雌性小鼠；与生理盐水组比较，*P<0.05；** P<0.01。图2 亚砷酸钠对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

2.2 对小鼠PCE/NCE比值的影响 雌、雄性小鼠各亚砷酸钠剂量处理组的PCE/NCE比值与生理盐水阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；相同处理雌、雄小鼠间PCE/NCE比值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。100 mg/kg CTX阳性对照组的雌性小鼠PCE/NCE比值和雄性小鼠PCE/NCE比值均低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注：*与同性别生理盐水组比较，P<0.05。图3 亚砷酸钠砷对小鼠骨髓PCE/NCE比值的影响

3 讨论

微核是指存在于细胞中主核之外的一种核酸颗粒，是细胞内染色体断裂或纺锤丝功能受影响在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。骨髓中成红细胞分化为红细胞的过程中，主核排出成为PCE，细胞保持其碱性约24 h，然后成为NCE。因此计数PCE细胞中微核可以排除主核的干扰，计数更为准确。Banerjee等[7]使用瑞士白化鼠为动物模型，检测到1.6 mg/kg三氧化二砷(As2O3)处理组小鼠骨髓PCE细胞微核率约为5‰。另有研究表明，砷可以诱导植物细胞微核率增加[8]。体外微核实验发现，砷可以诱导人淋巴微核率的增加[9]。国外的流行病学研究数据显示，砷暴露人群的微核率增加[10]，但国内未见相关报道。PCE为未成熟的红细胞，而NCE为成熟红细胞，PCE/NCE比值可以反映骨髓造血抑制情况，如比值<0.1，表示PCE形成受到严重抑制。本研究以昆明种成年小鼠为动物模型，检测了不同浓度NaAsO2对小鼠微核率的影响，在剂量选择上参考魏建宏[6]的研究报道。结果显示，1.5625～12.5 mg/kg剂量范围内的NaAsO2能够显

著增加雌、雄性小鼠骨髓PCE细胞的微核率，呈剂量依赖效应。雌、雄性小鼠各亚砷酸钠剂量处理组的PCE/NCE比值与阴性对照组比较，差异无统计学意义。本研究结果提示亚砷酸钠具有较强的促微核形成能力，12.5mg/kg NaAsO2剂量组的微核率与100 mg/kg CTX阳性对照组接近。

综上，亚砷酸钠具有较强的遗传毒性，但其诱导产生微核的机制尚需进一步研究。