郑 方，朱 晗，周 瑾，纪雅菲，张蓓蓓，黄 菲，吴晓俊

(上海市复方中药重点实验室暨上海中医药大学中药研究所，上海 201203)

抑郁症是一种心境障碍，表现为长期情绪失落、认知障碍、意志力下降等[1]，并且具有高致死率和高复发率的特点。世界卫生组织(WHO)最新数据显示，到2020年，抑郁症会成为世界上继冠心病后第二大疾病[2]。抑郁症具有繁杂的发病机制，通常认为与5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)等神经递质减少，下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴改变和免疫系统异常等因素有关[3]。最近的研究发现，肠道菌群和中枢神经系统(central nervous system，CNS)的功能关系密切，不仅影响胃肠功能，还影响CNS的生理和行为。同时，CNS也调控胃肠道功能，对肠道菌群丰度、群落等变化也有影响，这种相互作用的双向调节轴被称为微生物-肠-脑轴。CNS、自主神经系统(autonomic nervous system，ANS)、HPA轴、肠道内神经系统(enteric nervous system，ENS)等组成微生物-肠-脑轴中的神经系统，它们之间功能彼此协调[4]。胃肠道是由CNS、ANS、ENS联合控制身体的唯一器官，具有感觉和运动功能，号称“情绪反应堆”[5]。有报道称，无菌小鼠大脑皮质和海马体内的5-HT和多巴胺(dopamine，DA)水平明显降低[6]，提示肠道菌群可以影响神经递质分泌，因而可能在抑郁症的发病过程中发挥作用。已有证据表明，抑郁病患者肠道菌群发生明显变化[7]。另外，越来越多的证据表明，肠道菌群可以影响神经递质，如补充双歧杆菌可恢复无菌大鼠异常HPA轴功能亢进导致的抑郁[6]。16S rDNA的细菌分子生物学鉴定技术是一种快速获得细菌种属信息的方法[8]。本研究使用C57BL/6小鼠建立慢性轻度不可预知应激(unpredictable chronic mild stress，UCMS)抑郁模型，通过对小鼠肠道菌群16S rDNA的V4-V5区进行高通量测序，研究UCMS抑郁模型小鼠肠道的菌群变化，以期探寻抑郁症和肠道菌群的关系，为其新的治疗策略和药物研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 健康♂5周龄C57BL/6小鼠，平均体质量(20±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK(沪)2015-003。于上海中医药大学动物实验中心SPF级动物房昼夜各12 h饲养，温度(25±1) ℃，相对湿度40%～60%。

1.1.2 药物与试剂 戊巴比妥钠(批号：WS20140220)、色谱甲醇(批号：138507)、色谱乙腈(批号：173534)、色谱甲酸(批号：172433)，均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒，购自QIAGEN公司；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司。

1.1.3 仪器 高架十字迷宫、悬尾及强迫游泳测试仪，均购自上海玉研有限公司；液相质谱联用仪购自安捷伦(型号：DEBAF01206)；高通量组织研磨仪购自上海净信科技有限公司；高速离心机购自艾本德公司；C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)购自Waters；Illumina MiSeq 2 ×300 bp平台由Illumina公司提供。

1.2方法

1.2.1 实验动物分组及造模 C57BL/6小鼠购买后，适应性饲养1周，随机分为对照组(control)、模型组(model)，每组12只动物。对照组正常喂养，不给予任何刺激；模型组小鼠单笼饲养，并每天不定时随机给予以下刺激：束缚3 h，昼夜颠倒24 h，禁水12 h，禁食24 h，异物干扰24 h，潮湿垫料12 h，夹尾巴1 min，空笼24 h(笼中无垫料)。每种刺激不连续出现，总刺激时间为5周。

1.2.2 行为学检测 造模5周后，对小鼠分别进行糖水偏好测试(sugar preference test, SPT)、强迫游泳测试(forced swimming test，FST)、悬尾测试(tail suspension test，TST)、高架十字迷宫测试(elevated plus maze test，EPMT)。

1.2.2.1 SPT 测试前进行糖水适应，同时给予每只小鼠放置糖水和纯水，测试3 d，d 3称量糖水和纯水消耗量，计算糖水偏好率，比较两组间糖水偏好率。

1.2.2.2 FST 将小鼠置于装有18 cm深清水的柱型透明器皿内(高30 cm，直径20 cm)，实时记录6 min内后4 min每只小鼠的累计不动时间。

1.2.2.3 TST 用胶带黏住小鼠尾巴，将其倒挂于水平木棍上，记录6 min内后4 min每只小鼠的累计不动时间。

1.2.2.4 EPMT 将小鼠放入高架中央，且头部面朝开臂，实时记录小鼠5 min内进入开臂的时间。

1.2.3 样品采集 造模结束后，收集小鼠新鲜粪便3～4粒，置EP管中，保存于-80 ℃冰箱备用。在行为学实验结束之后，用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠，在冰上取出海马组织，保存在EP管中，并快速置于液氮中冻存，然后放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 神经递质检测 海马组织称重，每份样品加入350 μL的0.1%甲酸-甲醇，匀浆，15 000 r·min-1离心15 min(4 ℃)；取上清，氮气吹干，每份加100 μL流动相复溶，15 000 r·min-1离心15 min(4 ℃)，取出上清置于液相小瓶中待分析。液相条件：用0.1%甲酸-水(A相)，乙腈(B相)作为流动相进行梯度洗脱，0～4 min，0.02 B；6 min，0.8 B；8～10 min，0.9 B；流速0.1 mL·min-1。LC-MS/MS色谱条件参考本实验室已发表文献[9]。

1.2.5 16S rDNA测序与分析 对小鼠粪便样品进行高通量测序和分析。采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒，提取样品中微生物DNA。高通量测序分析16S rDNA的 V4-V5区基因序列。使用纯化的DNA作为模板，采用16S rDNA V4-V5区通用引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和926R(5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′)，对目的片段16S rDNA V4-V5区进行PCR扩增，采用2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收样本，将回收产物进行PCR扩增，目的片段两端加入测序所需的引物、接头和标签序列。 回收全部PCR产物进行荧光定量，文库构建完成。利用Illumina MiSeq 2×300 bp平台进行16S rDNA测序。

对所有有效原始数据进行筛选，获得优化序列，然后进行OTU聚类。基于分类学信息，在科分类水平上，进行群落结构的统计分析。采用mothur(Version 1.33.3)进行Alpha多样性分析(Chao、Ace等物种丰富度统计，Shannon、Simpson等物种多样性统计)、Beta多样性分析[(un)Weighted UniFrac分析]，利用R语言(Version 3.2.3)进行PCA分析。

2 结果

2.1UCMS抑郁模型小鼠抑郁相关行为改变如Fig 1A、1B所示，与正常对照组相比，UCMS模型组小鼠在悬尾和强迫游泳测试中，不动时间明显增加。同时，在十字高架迷宫实验中(Fig 1C)，模型小鼠进入开放臂的时间明显少于正常对照。与正常对照组相比，模型组小鼠糖水偏好率明显降低(Fig 1D)。

Fig 1 Effects of UCMS on mouse behaviors and

A: Immobility time in TST; B: Immobility time in FST; C: Time spent in open arm of EPMT; D: Sugar water consumption/water consumption.**P<0.01vscontrol.

2.2UCMS抑郁模型小鼠海马神经递质的变化如Tab 1所示，UCMS模型组小鼠海马区5-HT、DA、NE含量明显降低，而谷氨酸(Glu)含量在UCMS模型组中则明显上升，表明慢性应激改变了小鼠海马神经递质表达。

Tab 1 Effects of UCMS on neurotransmitter contents in hippocampus of mice n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3微生物群落Alpha多样性分析Alpha多样性包括Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数等。前面3个指数越大，表明样品中物种丰富度越大，而Simpson指数则相反。Chao指数和Ace指数是指不考虑群落中每个物种的丰度情况下，群落中物种的数量，可反映样品中群落的丰富度。Shannon指数和Simpson指数则反映群落的多样性，受样品群落中物种丰富度和物种均匀度的影响。相同物种丰富度的情况下，群落中各物种均匀度越大，则群落的多样性越大[10]。

如Tab 2所示，UCMS抑郁模型组小鼠Chao指数和Ace指数明显低于正常对照组，说明UCMS抑郁模型组菌群丰富度较正常对照组降低。UCMS抑郁模型组小鼠Shannon 指数明显低于正常对照组，Simpson 指数高于正常对照组，说明UCMS抑郁模型组肠道菌群多样性明显降低。

Tab 2 Fecal microflora of Alpha diversity in control and model groups n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4微生物群落结构差异性分析如Fig 2所示，在科(family)水平上，两组样品聚类树与群落结构组成柱状图，a图左侧为通过非加权组平均法UPGMA构建进化树的层次聚类分析，显示不同环境样品中，微生物进化上的相似性及差异性，右侧是样品的群落结构组成柱状图。从层次聚类分析图可以看出，UCMS抑郁模型组相对于正常对照组有明显差异，群落结构柱状图显示，两组样品在科水平上的菌群组成主要包括Unclassified、Lactobacillaceae、Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae、Bacteroidaceae、Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae等8个科，占菌群总量的90%以上，其中Unclassified、Lachnospiraceae这两个科的菌群占总量的60%以上。与正常对照组相比，UCMS抑郁模型组Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Peptococcaceae、Clostridiaceae、Corynebaceriaceae微生物群落比例明显降低，而Verrucomicrobiaceae、Alcaligenaceae微生物群落比例明显升高(Fig 2b)，说明UCMS造模后，小鼠粪便微生物群落结构发生明显变化。

为了进一步分析两组间粪便微生物群落结构的差别，对每个样品的OTU信息进行未加权的Unifrac距离矩阵构建。基于这一矩阵进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，通过分析不同样品OTU信息组成，来反映样品间的差异和距离。如Fig 3所示，该分析前两个主成分分析分别解释了总变量的58.3%和13.37%；从PC1轴水平看出，UCMS抑郁模型组与正常对照组样品组内距离很短，但两组间的距离很远，说明UCMS抑郁模型组与正常对照组微生物群落结构差异性较大。

Fig 2 Microbial community barplot with cluster tree

1: Lachnospiraceae; 2: Prevotellaceae; 3: Verrucomicrobiaceae; 4: Alcaligenaceae; 5: Peptococcaceae; 6: Clostridiaceae; 7: Corynebacteriaceae. a: Microbial community barplot at family level; b: Fecal microflora structure difference at family.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 3 PCA plot based on unweighted Unifrac metrics

2.5LDAEffectSize组间群落差异分析LEfSe是一种用于发现高维生物标识和反映基因组特征的软件，可以区分两个或更多种生物条件(或者类群)。该分析首先使用非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验，检测具有明显丰度差异特征，找到与丰度有明显差异的类群。然后，采用线性判别分析(LDA)，估算每个组分(物种)丰度对差异效应的影响。根据分类学构成，按照不同分组条件对样品进行LDA，找出样品分区中具有明显差异影响的群落或物种。

Fig 4 LEfSe analysis identified biomarker bacteria between model and control group

为具体分析UCMS抑郁模型组相对于正常对照组菌群丰度变化，用LEfSe分析对UCMS抑郁模型组和正常对照组的菌群相对丰度进行比较，找出UCMS抑郁模型组明显变化的菌群。如Fig 4所示，通过LEfSe分析，发现在门(phylum)水平上，疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门(Proteobacteria)在UCMS抑郁模型组菌群丰度明显升高，脱铁杆菌门(Deferribacteres)与硬壁菌门(Firmicutes)丰度明显降低；同时，UCMS抑郁模型组相较正常对照组，疣微菌目(Verrucomicrobiales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和棒杆菌目(Corynebacteriales)3种菌群丰度在目(order)水平明显增加，而脱铁杆菌目(Deferribacterales)与梭菌目(Clostridiales)菌群丰度下降；疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)在科(family)水平明显升高，脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)5种菌群丰度较正常对照组明显降低；在种(species)水平，有7个种的菌群丰度升高，分别是Uncultured_bacterium、Gut_metagenome、Akkermansia_muciniphila、Uncultured_rumen_bacterium、Uncultured_Erysipelotrichales_bacterium、Corynebacterium_stationis、Acinetobacter_lwoffii、Bacteroides_thetaiotaomicron；另外，11个种的菌群丰度明显降低，包括Bacteroides_vulgatus、Lachnospiraceae_bacterium_DW12、Lactobacillus_intestinalis、Clostridiales_bacterium、Candidatus_Arthromitus_sp_SFB_mouse_NL、Rikenella_microfusus、Alistipes_timonensis、Clostridium_leptum、Uncultured_organism、Bacteroides_acidifaciens、Uncultured_Clostridiales_bacterium、Uncultured_Bacteroidales_bacterium。

3 讨论

UCMS抑郁小鼠模型是经典的抑郁动物模型，可模拟临床抑郁病人的症状。在本实验中，抑郁模型组小鼠的糖水偏好率降低、悬尾测试和游泳测试不动时间明显增加，同时高架迷宫测试进入开放臂时间明显减少，这些结果提示小鼠具有典型的抑郁症状。另外，抑郁小鼠海马区神经递质如5-HT、NE、DA含量明显降低，证实了抑郁模型的成功建立。

Illumina高通量测序技术又被称为“下一代”测序技术，是利用专属的可逆终止子化学方法，一次性对几十万到几百万条DNA片段进行测序的新一代大规模测序技术[11]。本实验采用Illumina高通量测序技术，分析慢性应激抑郁模型小鼠肠道菌群变化，结果表明，与正常对照组相比，慢性应激抑郁模型组Chao指数、Ace指数、Shannon指数明显降低，以及Simpson指数升高，表明慢性应激抑郁模型组小鼠的肠道菌群的群落丰富度和多样性明显降低。另外，慢性应激抑郁模型小鼠的肠道菌群群落结构组成发生明显改变，这些明显变化的菌群主要集中在疣微菌、变形菌、棒状杆菌、脱铁杆菌、拟杆菌和梭菌这6种肠道微生物中，模型小鼠肠道中疣微菌、变形菌、棒状杆菌3种菌丰富度明显升高，而脱铁杆菌、拟杆菌、梭菌明显降低。大量研究证明，当潜在致病菌大量存在于肠道内时，外周的免疫反应将会被触动，宿主的行为随之被改变[12]。变形菌门是肠道内的潜在致病菌，它可以通过Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统侵入肠上皮细胞，然后直接作用于宿主细胞[13]。因此，肠道内变形菌门的明显升高可能与小鼠抑郁样行为的发生有关联性。临床研究也表明，与正常人相比，重度抑郁症患者粪便样品中的变形杆菌丰度升高，拟杆菌、梭菌和硬壁菌丰度下降[13]。这些临床研究结果与本实验结果相符，表明该抑郁动物模型与临床抑郁患者肠道菌变化基本一致。另外，关于疣微菌、棒状杆菌和脱铁杆菌与抑郁症关联性报道较少，在本实验中，这3种菌都明显改变，提示其可能是抑郁相关的靶向菌。

关于肠道菌与抑郁症两者间是如何相互影响的问题，微生物-肠-脑轴是主流学说，其机制并没有完全被解释清楚。有研究表明，迷走神经是肠道菌与大脑间交流的重要途径[14]，切除迷走神经后，鼠李糖乳杆菌丰度会大量降低。另外，肠道菌会调节神经递质，肠道菌调控前体水平来调节5-HT。婴儿双歧杆菌提高了血浆色氨酸水平，从而影响中枢系统5-HT的传导。一些肠道菌能够合成并分泌神经递质，可以穿过小肠黏膜层，但它们很难直接通过血脑屏障影响到大脑功能，其作用可能是通过微生物-肠-脑轴实现[14]。

综上所述，本实验发现UCMS模型小鼠肠道菌群的菌群丰富度和结构组成发生明显变化，一方面证实了抑郁和肠道菌群改变的相关性，另一方面表明该抑郁模型可以作为靶向调控肠道菌群抗抑郁药物研究的可靠工具。