王亚萍 陈 锴 李东琴 田 璞 刘永仙 李宝莉**

(1.延安大学医学院, 陕西延安 716000； 2.延安大学附属医院, 陕西延安 716000； 3.南昌大学第二临床医学院医学影像专业，江西南昌 330000)

阴道毛滴虫TrichomonasvaginalisDonne 1837是寄生在人体阴道和泌尿道的鞭毛虫，主要引起滴虫性阴道炎和尿道炎，以性传播为主。目前，WHO推荐的治疗阴道毛滴虫的药物为甲硝唑，但此类药物脂溶性较高，且易透过胎盘和血脑屏障，如果孕妇服用，则可能导致胎儿畸形，经动物实验表明此药对啮齿类动物有致癌作用(WHO, 1996)。由于临床分离的阴道毛滴虫因遗传变异引起耐药株的出现，进而临床用药剂量加大，副作用增加(刘建华等，2013；Senaetal., 2014; Hawkinsetal., 2015; Keatingetal., 2015; Maoetal., 2015)。国内研究了较多单剂和复方中药制剂对阴道毛滴虫的作用，中药复方制剂内多含黄芩、白头翁、苦参、黄连、菊花、蛇床子、黄芪、黄柏等，用中药单剂杀阴道毛滴虫，存在用药量大、疗程长、杀虫效果不及西药制剂等缺点(白静等，2014)。此外，Lindmark等(2014)报道甲硝唑由于能使细菌突变而对人有潜在的威胁。因此，寻求高效、低毒、新型的药物是防治阴道毛滴虫病的主要研究方向之一。本研究选用中药坤泰洗剂进行体外抗滴虫作用, 初步探讨该药对阴道毛滴虫的杀虫疗效。

1 材料与方法

1.1 实验虫株来源

虫株取自延安大学附属医院妇科门诊，无菌环境下，用棉签拭子从滴虫性阴道炎患者阴道后穹窿部位取阴道分泌物，按照张潞渝等(2011)的培养方法，将其接种于含有胎牛血清及青霉素、链霉素的1640培养基中，并置 37 ℃培养箱内培养 24 h 后，转种 1 次。收集虫体，继续培养48 h，待其稳定生长后，吸取少量虫液涂片，自然干燥后，进行瑞氏-吉姆萨染色，光镜下镜检。同时在无菌条件下，收集培养液中的虫体，以2 000×g离心8 min后，去掉2/3上清液，用不含血清的培养液洗涤 2次后收集虫体、计数，制成5×104浓度的虫液，于 37 ℃水浴箱中，用0.4%台盼蓝计算虫体活力(活虫台盼蓝不着色，死虫体着色呈蓝色)，活虫占 99%以上，以上操作在25 ℃的室温下进行。

1.2 实验药物

坤泰洗剂由五倍子RhuschinensisMill.、白芷Angelicadahurica、石斛DendrobiumnobileLindl、丁香Syringa Linn、川芎LigusticumchuanxiongHort、当归Angelicasinensis、珍珠Pernulo、红参Radixginsengrubra等8种中草药组成，其各成分均购自延安大学附属医院中药房。阳性药物甲硝唑为片剂，200 mg/粒，批号 20020930，湖北华中制药厂产品。洁尔阴洗液300 mL/瓶, 国药准字Z10930008，四川恩威制药有限责任公司。

1.3 实验材料

RPMI1640培养基购自赛默飞公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自杭州四季青有限公司；瑞氏-吉姆萨染色液购自武汉博士德生物有限公司；0.4%台盼蓝、光学显微镜、无菌操作台、培养箱等均由延安大学医学院实验中心提供。

1.4 药液的制备及分组

坤泰洗剂各称取一定量的中药药材, 分别取五倍子30 g、白芷10 g、石斛10 g、丁香10 g、川芎10 g、珍珠40 g、当归10 g、红参50 g,破碎后除去其杂质,并冲洗干净,后干燥、粉碎，经40目过筛,按实验药物剂量最优组合加80%乙醇，水浴3 h，过滤，抽离,萃取，计算得出萃取率为17.27%，经旋转蒸发器蒸发酒精，烘干，刮取干粉，经配比计算得出原液浓度为4.21 mg/mL，按预实验结果，将药物浓度用无血清培养液稀释为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16共5个浓度组。甲硝唑制成粉末，取0.2 g 加入无血清1640液 25 mL，制成原浓度为 8 mg/mL，按倍比稀释为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。10%洁尔阴洗液原液，同样用无血清培养液按照浓度比1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释为5组，用移液器将各种药液加入 24 孔培养板，每孔 3 mL。 本实验设坤泰药物组、甲硝唑组、洁尔阴洗液组及RPMI-1640 培养液组和 80%乙醇浸泡组(取坤泰洗剂混合组称取5.5 g药材粉末并加入22.5 mL 80%的乙醇于圆底烧瓶中，浸泡23 d，封口以备用)。

1.5 滴虫在药液中的培养

在已配好的药液中， 分别加入阴道毛滴虫 5×104个，将培养板置于37 ℃培养箱培养2、6、12、24、48 h，后吸取各孔虫液，滴入计数板内，高倍显微镜下镜检,计算虫体死亡率。对死亡率为100%的实验管进行转种，37 ℃继续培养24 h，观察是否有滴虫存活。所有实验重复3次。

1.6 虫体计数过程

置显微镜下数计数板内四角大方格内的虫体总数，只计对角线的虫体，对于压线的只计在上线的和坐线的，若成团的虫体则按单个虫体计算。虫体数=(4 大格细胞总数÷4)×104(个/mL)。

2 结果

2.1 实验药液对阴道毛滴虫的杀虫效果

1∶1坤泰洗剂作用阴道毛滴虫2 h 时，杀虫率为93.47%。不同浓度组的坤泰洗液作用阴道毛滴虫24 h 后，均有不同程度抑制作用，1∶2、1∶4、1∶8浓度组作用24 h后杀虫率都达到100%，可见坤泰洗剂体外外最低杀虫稀释度(minimal lethal concentrations， MLCs)为1∶8。1∶1甲硝唑作用阴道毛滴虫2 h后，杀虫率为90.92%，甲硝唑在1∶8、1∶16低浓度组作用24 h后仅有抑制阴道毛滴虫的作用，而在1∶2、1∶4高浓度组作用 24 h后抗阴道毛滴虫率为100%，并继续培养24 h后，染色镜检活虫率为0%。故以1∶4稀释浓度组作为甲硝最低杀虫稀释度。洁尔阴洗剂 1∶1 稀释浓度组2 h时的杀虫率为83.45%，稀释度1∶16作用24 h有不同程度抑制滴虫生长的作用，1∶1、1∶2稀释浓度组在 24 h已全部杀灭阴道毛滴虫，且48 h后未见阴道毛滴虫生长，稀释浓度 1∶2为洁尔阴洗剂对阴道毛滴虫最低抑虫浓度。

从实验结果(表1)可以看出，随着作用时间的延长，药物的杀虫效果逐渐增强，对滴虫的抑制率随着药物浓度的增加而增加。将药物抗虫后无滴虫生长的阴性培养液吸出，用不含血清培养液洗涤后，转入含血清的新鲜培养液继续培养24后，未见滴虫生长。乙醇浸泡组和无药对照组滴虫生长良好，24 h滴虫死亡率小于5%，说明实验结果有效。

2.2 显微镜下形态

镜下观察对照组阴道毛滴虫，虫体圆形或椭圆形，无色透明,可见鞭毛摆动，运动活跃。经瑞氏-吉姆萨染色后,虫体多呈椭圆形或梨形, 结构完整, 轮廓清晰 (图1-a)。经药物作用后,其形态发生明显变化。选取坤泰洗剂1∶4作为实验组作用24 h后观察,染色后油镜观察，其虫体收缩变圆,部分虫体裂解、内容物外溢、边缘不整,甚至分解为碎片(图1-b)。

表1 坤泰洗剂及各药体外对阴道毛滴虫杀虫效果(n=5)Fig.1 The effect of Kuntai Lotion on the T. vaginalis in vitro

图1 阴道毛滴虫形态观察Fig.1 Trichomonas vaginalis under microscopesa.瑞氏-吉姆萨染色；b. 坤泰洗液1∶4作用24 h后的滴虫。a. T. vaginalis stained by Wright-Giemsa staining method；b. Trichomonas vaginalis after treated by Kuntai Lotion 1∶4 for 24 h.

2.3 实验药液对阴道毛滴虫的杀虫效果的统计分析

根据药物对阴道毛滴虫的杀虫率，对表1 中不同处理组的药物及作用12 h后进行方差分析检验。1∶8浓度组坤泰洗剂对阴道毛滴虫的作用与80%乙醇浸泡组在同时间对比，P值0.03(P<0.05)；R同时与RPMI-1640 培养液对比，P值为0.02(P<0.05)，均具有统计学意义。通过方差分析，1∶8坤泰洗剂同1∶4甲硝唑杀虫效果相近，P值为0.43(P>0.05)，差异无显著性，无统计学意义；与1∶8洁尔阴洗液相比，具有显著差异性，P<0.05，差异有统计学意义，杀虫效果强于洁尔阴洗液。见表2。

表2 坤泰洗剂对滴虫的体外方差分析Tab.2 Analysis of variance to KunTai Lotion on T.vaginalis in vitro

3 讨论

据报道，治疗滴虫性阴道炎的中药已有很多种类(陈熙等，2012；Sharafietal., 2013; Ezz Eldinetal., 2015; Kashanetal., 2015; 张广求, 2016)。 本实验研究复合中药坤泰洗剂对阴道毛滴虫的杀虫作用。本实验坤泰洗剂是由五倍子、石斛、白芷、丁香、珍珠、川芎、红参、当归等8味中草药复方组成，其中五倍子为主药，白芷、珍珠粉、川芎、人参等其他药为配方组成，研究表明五倍子、石斛、白芷、丁香、红参、当归、珍珠粉、川穹均具有抗菌、抗滴虫作用(Lindmarketal., 1976; 于庆杰等，2009；杨雅西等，2012)，尤其以五倍子、白芷的功效较为显著。潘玉华等(2002)对8种中药体外抗滴虫的研究表明五倍子具有显著的杀虫作用，丁香具有抑制滴虫生长的作用，而珍珠、当归、石斛、人参能增强机体免疫功能。

从实验结果来看，坤泰洗剂对阴道毛滴虫具有显著的抗虫效果，在同时间、相同稀释浓度，坤泰洗剂杀虫效果与甲硝唑近似，其体外杀虫的最低杀虫浓度1∶8， 坤泰洗剂 1∶1浓度对阴道毛滴虫在 2 h杀虫率93.47%，且随着药物浓度的递增，作用时间的延长，24 h内，阴道毛滴虫的杀死率逐渐增高，即药物的浓度和作用的时间同杀虫效果呈正相关。若作用于患者体内是否具有相同的效果，有待进一步研究探索。