董海龙，王 琳，张作刚，畅引东，王建明

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心运城分中心，山西运城044600）

根结线虫病是全球范围内严重影响蔬菜设施栽培产量的重要根部病害之一，具有分布广泛性、多寄主性、强侵染性和发生危害隐蔽等特点[1]。随着设施蔬菜栽培的迅猛发展，根结线虫的发病率逐年上升，严重地区可减产30%～40%，甚至绝收[2]。目前，农业上防治其的最主要手段仍是喷洒农药和土壤消毒，从而造成农药大量残留、环境污染。因此，提高蔬菜的品质和产量，寻求安全、高效、环境友好型根结线虫防治措施，已成为蔬菜产业迫在眉睫的重要需求。

真菌生防制剂作为环境友好型生物防治技术手段愈来愈受到人们的关注[3]，其产品多利用真菌孢子加工而成，国内外真菌杀虫剂的产业化多采用液-固双相发酵方法[4]。采用该方法前期将液体深层发酵培养出芽生孢子接种到后期的固体基质中产生分生孢子，适用于很多生防菌剂的大规模工业生产[5]。绿色木霉菌（Trichoderma viride）[6]、淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）[7]、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）[8]、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）[9]均是通过优化液-固双相发酵方法获得较好的产孢量。

疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）是重要的线虫生防真菌，该菌代谢产物主要防治根结线虫属、异皮线虫属、球藻属、小垫刃属等19个属的线虫[10]。其分生孢子作为生防制剂用于农业病虫害防治，国内外研究还较少。前期研究表明，根结线虫生物防治课题组保藏的1株疣孢漆斑菌X-16菌株对根结线虫有较强的寄生作用，具有开发成生防菌剂在农业生产中广泛应用的潜力。

本研究旨在探究疣孢漆斑菌X-16的生物学特性，开发该菌株的活菌制剂，以期对今后的工厂化生产该菌株的生物防治剂提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）菌株X-16，由山西农业大学植物病理实验室提供。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH值自然。基础培养基：磷酸氢二钾1 g，硫酸亚铁0.01 g，七水硫酸镁0.5 g，蒸馏水1 L，pH值自然。固体平板培养基是在PDA培养基的基础上添加琼脂18 g/L。

1.1.3 主要药品试剂 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硝酸钠、蛋白胨、酵母膏、尿素、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、七水硫酸镁、琼脂，均购自奥博星生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同碳氮比（摩尔比）对X-16菌株产孢量的影响 以葡萄糖和硝酸钠为基础培养基的碳源和氮源，设置 C/N 为 5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，60∶1，80∶1，100∶1和 120∶1。平板接菌培养 10 d后，利用血球计数板测定X-16菌株产孢量。每个处理设置4个重复。

1.2.2 不同碳浓度对X-16菌株产孢量的影响 以葡萄糖和硝酸钠为基础培养基的碳源和氮源，设置0.5，1.0，2.0，4.0 mol/L共 4 个碳质量浓度，测定方法同1.2.1。每个处理设置4个重复。

1.2.3 不同碳源、氮源种类对X-16菌株产孢量的影响 以硝酸钠为基础培养基的氮源，设置葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉为5个碳源；以葡萄糖为基础培养基的碳源，设置硝酸钠、蛋白胨、酵母膏和尿素4个氮源。每个处理设置4个重复，同时以无碳、氮源为空白对照。

1.2.4 不同温度对X-16菌株产孢量的影响 以PDA培养基为供试培养基，设置 15，20，25，28，30，32，35，37℃共8个温度。每处理设置4个重复。

1.2.5 不同pH对X-16菌株产孢量的影响 以PDA培养基为供试培养基，设置pH值3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 等处理。每个处理设置4个重复。

1.2.6 不同光照条件对X-16菌株产孢量的影响以PDA为供试培养基，在25℃下设置0，12，24 h光照。每个处理重复4次。

1.3 数据处理

利用SPSS数据处理系统和Excel XP进行统计分析，数据之间用Duncan新复极差法进行方差分析比较。

2 结果与分析

2.1 不同碳氮比对产孢量的影响

从图1可以看出，疣孢漆斑菌在碳氮比是60∶1时产孢量最高，且与其余碳氮比间有显著或极显著差异（P＜0.05，P＜0.01）；碳氮比 20∶1 产孢量次之；而碳氮比是5∶1时，固体平板不产孢。

2.2 不同碳源浓度对产孢量的影响

疣孢漆斑菌在碳浓度为1.0 mol/L时，产孢量最大，且与其他3个浓度间有显著或极显著差异（P＜0.05，P＜0.01）；浓度为 4.0，2.0 mol/L 时，产孢量较小（图 2）。

2.3 不同碳源、氮源种类对产孢量的影响

疣孢漆斑菌在可溶性淀粉为碳源的固体平板中产孢量最大，其次有机碳源是蔗糖，麦芽糖、葡萄糖、乳糖相对较少（图3）。

疣孢漆斑菌在含有无机氮源硝酸钠的固体平板中产孢量最大；其次依次是蛋白胨、酵母膏、尿素；无氮源对照处理产孢量最小（图4）。

2.4 不同温度对产孢量的影响

疣孢漆斑菌在15～37℃范围内均可产孢，但28～35℃产孢量显著高于低温25℃和高温37℃，其中，30℃产孢量最大，其次为32℃；方差分析结果表明，25，28，35，37 ℃之间产孢量无显著差异（图 5）。

2.5 不同pH条件对孢子萌发和产孢量的影响

疣孢漆斑菌在pH值3.5～9.0范围内均可产孢，但pH值为6～8时产孢量显著高于其他pH值（P＜0.05），pH值为6.5时产孢量最高。菌株X-16对产孢环境的酸碱适应性较强，变酸环境有利于产孢。

2.6 不同光照时间对产孢量的影响

疣孢漆斑菌在24 h全光照下产孢量最大，其次是全黑暗条件。方差分析结果表明，24 h光照和全黑暗产孢量间差异显著（P＜0.05）。

3 结论与讨论

疣孢漆斑菌分生孢子可寄生根结线虫卵、二龄幼虫和雌虫[11]，该菌寄生线虫过程中培养基的营养成分和环境因子如温度、光照等对其产孢量、孢子萌发及致病力有显著影响。有研究表明，提高疣孢漆斑菌产孢力的营养和环境条件，有助于提高该菌生防效果。本研究结果表明，疣孢漆斑菌X-16菌株产孢量最大的营养条件为：碳氮比60∶1在平板培养中生长最好；最适碳源是可溶性淀粉，碳浓度为1～2 mol/L时最有利于平板产孢；最适氮源是无机氮源硝酸钠，有利于增加产孢量；环境条件为适宜菌株X-16产孢的温度是30～32℃；适宜产孢的pH值是6.5；24 h光照有利于产孢。

肖顺[12]研究报道，淡紫拟青霉菌株PL89产孢最适碳源是可溶性淀粉，最适氮源是酵母粉，本研究中X-16对碳源的利用与淡紫拟青霉相似，但最适氮源是硝酸钠，与PL89有所不同；宋漳等[13]研究报道，绿僵菌最适产孢温度是28℃，菌株X-16在30～32℃适宜产孢，较绿僵菌温度生长范围宽；朱茂山等[14]研究报道，木霉菌T41适宜产孢的pH值为2～11，其中，pH值为5的偏酸性条件下，T41菌株产孢量最大，全光照有利于产孢。菌株X-16适宜产孢pH值为6.5，光照条件是24 h全光照。不同营养和环境对球孢白僵菌HFW-05影响中发现，最适产孢的碳源为蔗糖、氮源为豆粕粉、无机盐对产孢量有抑制作用，而25℃外加紫外线照射1 h有利于产孢[15-16]。

疣孢漆斑菌是生物防治寄生线虫的重要真菌，该菌代谢产物在欧洲已被登记用于果树、蔬菜、作物寄生线虫的防治，商品名称是DiTera_DF DiTera_WP[10]。关于疣孢漆斑菌活体制剂的发酵条件国内外尚无详细报道。本研究结果可为疣孢漆斑菌的固-液双相发酵提供参考。但本研究未评价中微量元素、维生素、金属离子、土壤化学农药和盐碱度对疣孢漆斑菌平板培养产孢影响，仍需进一步研究。