BARANYIKA Jean Baptiste，马晓燕，王慧慧，FIDINIAINA Rina Juliana，蒲首丞，孙梅好

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

植物内生菌是指那些在植物一生中的某个阶段或全部阶段，能够进入植物的组织和器官内部，与植物共同生存，且不会引发植物组织变化的真菌或细菌。但也可能由于植物自身衰老或一些外界条件刺激，内生菌导致植物免疫力下降，进而产生一些病症[1-3]。内生细菌与植物在长期的进化过程中，形成了一种互利共生的关系，而且有助于植物抵抗恶劣环境，提高植物的生存能力[4]。内生细菌与根际细菌相比，其生存能力更强，抵御一些生物胁迫和非生物胁迫的能力也要强，而且有助于植物对难降解物的降解，有助于生物防治[5-6]。除此之外，植物内生细菌在植物体内有稳定的生存空间，较难受外界环境的影响[7-8]。而且有关植物内生细菌在生防、促生以及固氮作用方面进行了大量研究，证明其有利于生物防治[9-13]。植物内生细菌内有很多植物病原菌的拮抗菌株，而且不同植物种类不同[14-18]。

菌株的生长受许多因素影响，如培养基的pH、温度、接种量和种龄等。为了提高其生长速度，缩短培养时间，本试验选取培养时间、温度、pH和接种量进行单因素试验来确定菌株的最佳生长条件，再由单因素试验结果选择3个影响较大的因素进行正交试验，根据正交试验结果获得更优化的生长条件，从而通过最优的条件培养，获得JX-3菌株的最大生长量。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株为银杏内生细菌JX-3。将银杏叶外表面清洗消毒、磨碎，然后涂布于NA固体培养基上，进而挑选单菌落，将其命名为JX-3。

NA培养基为胰蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，蔗糖10 g，牛肉膏3 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 制备种子液 将活化好的JX-3菌液吸取2 mL加到装有100 mL的NA培养基的250 mL三角瓶中，于37℃，220 r/min振荡培养至对数期，即为JX-3的种子液（OD560值在0.4～0.8即可）。

1.2.2 氯化铝反应 用移液枪吸取JX-3种子液50 μL点在无菌滤纸上，再对着该点喷洒少量2%的AlCl3乙醇溶液，吹风机吹干后置于紫外灯下观察。

1.2.3 单因素试验 按照接种量、培养基的pH、温度和培养时间4个条件对JX-3菌株的生长条件进行优化，在600 nm波长下测定菌液的OD值。

设置 5 个培养时间，分别为 1，2，3，4，5 h，将培养的种子液接种于NA液体生长培养基中，总体积为5 mL/管，然后置于30℃，220 r/min摇床中振动培养，分别测定其吸光度（OD560）。

设置 5 个温度梯度，分别为 40，35，30，25，20℃，接种种子液于NA液体生长培养基中，总体积为5mL/管（4 mL NA液体和1 mL种子液），置于相应温度、220 r/min摇床中振动培养3 h，分别测定其吸光度（OD560）。

设置 5 个 pH 值，即 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，将种子液接种于NA液体生长培养基中，总体积为5 mL/管，置于30℃，220 r/min摇床中振动培养3 h，分别测定其吸光度（OD560）。

设置7个接种量，即16%，14%，12%，10%，8%，6%，4%，将培养的种子液接种于NA液体生长培养基中，总体积为5 mL/管，然后置于30℃，220 r/min摇床中振动培养3 h，分别测定其吸光度（OD560）。

1.2.4 正交试验 根据单因素试验结果，设置正交试验表，选择时间、接种量和温度这3个因素分别做3组水平重复。按照设置的细菌JX-3正交试验表接种到试管中，每管总体积为5 mL，于220 r/min对应正交温度下振荡培养相应时间，并分别测定其吸光度（OD560）。

2 结果与分析

2.1 氯化铝反应结果分析

氯化铝反应发现有黄绿色荧光出现，说明样品中可能含有黄酮类化合物，即JX-3菌株可以产黄酮类化合物。

2.2 不同培养时间对JX-3菌体生长的影响

由图1可知，培养时间为4 h时，所获得菌液的OD值最大，为0.843，说明培养时间为4 h时内生菌JX-3的生长效果最好。

2.3 不同温度对JX-3菌体生长的影响

由图2可知，当温度为35℃时，所获得菌液的OD值最大，为0.779，说明35℃时内生菌JX-3的生长效果最好。

2.4 不同pH值对JX-3菌体生长的影响

从图3可以看出，当pH值为7.0时，所获得菌液的OD值最大，为0.694，说明在pH值7.0时内生菌JX-3的生长效果最好。

2.5 不同接种量对JX-3菌体生长的影响

从图4可以看出，接种量为12%时，所获得菌液的OD值最大，为0.635，说明接种量为12%时内生菌JX-3的生长效果最好。

2.6 正交优化试验

由表1可知，细菌JX-3的R值排序为：时间＞pH＞接种量，所以，JX-3的最佳生长条件为：培养时间5 h，pH值7.0，接种量8%。

表1 银杏内生细菌JX-3生长的正交试验结果

3 讨论

银杏内生细菌对银杏的生长发育有重要的作用，本试验获得了银杏内生细菌JX-3的最优生长温度、pH和接种量。关于内生细菌与植物之间的互利关系还需要更深入的研究，更清楚准确的机制进而解释这种关系。