贾晓芳,张勤丽,张 玲

(山西医科大学公共卫生学院劳动卫生学教研室,太原 030001)

铝在生产生活中应用极为广泛,可通过呼吸道、消化道等多种途径进入人体。研究表明,铝可透过血脑屏障进入脑组织,引起神经细胞病理改变,进而造成神经细胞死亡。神经细胞死亡是铝神经毒性效应的重要表现,多种信号通路、多种细胞因子共同参与该病理生理过程[1-3]。MAPK信号通路即丝裂原活化蛋白激酶信号通路是哺乳动物体内重要的信号转导通路,调节细胞的生长、分化、对环境的应激及炎症反应等多种重要的细胞生理病理过程。以往研究表明,MAPK路信号通路的激活介导某些细胞的死亡[4-6]。本课题组最近的研究从检测MAPK信号通路的蛋白表达水平出发,发现MAPK信号通路在铝致PC12细胞死亡过程中起重要作用[7],那么,在铝致小鼠神经元细胞死亡过程中,MAPK信号通路的相关基因会发生哪些变化?

基于此疑问,本实验通过建立铝致神经元细胞死亡模型,应用Agilent小鼠全基因芯片检测MAPK信号通路基因在神经元细胞死亡过程中表达谱的变化,对差异表达基因深入分析,从而为进一步探讨MAPK信号通路在铝致神经元细胞死亡过程中的作用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

AlCl3(美国Sigma-Aldrich公司,纯度为99%),L-谷氨酰胺、左旋多聚赖氨酸(美国Sigma公司),DMEM培养基(美国Gibco公司),胰蛋白酶(北京邦定生物医学公司),Neurobasal-A培养液、B-27神经细胞生长添加剂(美国Gibco公司),CCK-8(日本同仁化学研究所),TRIzol Regent(美国Invitrogen公司),Prime Script RT Master Mix(日本Takara公司),SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本Takara公司)。二氧化碳培养箱(美国Thermo公司),SW-CJ-2F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司),酶标仪(美国BioTek公司),PCR仪(美国Bio-rad公司)。

1.2 小鼠神经元细胞原代培养及实验分组

培养皿的预处理:培养皿(直径35 mm)中加入20 μg/ml左旋多聚赖氨酸1 ml,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中,6 h后用D-Hank’s清洗2次待用。1-3日龄昆明小鼠(山西医科大学生理学实验室提供),无菌取小鼠脑,除去脑膜及白质,收集大脑皮质并制成匀浆,放入加有1 ml 37 ℃预热的浓度为0.25%的胰蛋白酶的离心管中，轻轻吹打,制成单细胞悬液。静置,将上层细胞悬液经220目滤网过滤移入含2 ml全细胞培养液的离心管中终止消化,吹打均匀,1 000 r/min离心5 min,弃上清。加入2-2.5 ml全细胞培养液重悬,接种于多聚赖氨酸预处理过的培养皿,2 ml培养液中加入8 μl阿糖胞苷(0.5 g/L)以抑制胶质细胞生长。于37 ℃、5% CO2培养。

在细胞培养的第5天,选取生长良好的同批次神经元细胞,分为对照组和染铝组,对照组中只加培养液,染铝组铝的浓度为100 μmol/L AlCl3,染毒48 h后,进行后续实验。

1.3 小鼠神经元细胞活力检测

以1.5×105个/ml密度将细胞接种于多聚赖氨酸包被过的96孔板,每组设5个复孔,重复3次。在培养的第5天对细胞染毒,染毒48 h后每孔加入5 μl CCK-8,继续培养2 h,用酶标仪在波长450 nm检测吸光度值。

1.4 RNA的提取与纯化

1.5 基因芯片实验

采用Agilent表达谱4×44K芯片配套试剂盒和标准操作流程对样品总mRNA进行放大和标记,并用QIAGEN RNeasy®Mini Kit纯化标记好的cRNA。在滚动杂交炉中65 ℃,10 r/min杂交17 h,杂交cRNA上样量为1.60 μg,并在洗缸中洗片。采用Agilent扫描仪扫描芯片结果,Feature Extraction软件读取和分析数据。最后应用Bioconductor进行归一化处理。根据信号强度和图像质量对基因进行标记,筛选差异表达基因。该部分实验由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.6 基因芯片实验数据分析

比较组间基因变化水平,其比值(Ratio)进行log2对数处理,log2Ratio>1为基因表达明显上调,log2Ratio<-1为基因表达明显下调。采用SAS系统在线分析,上传已筛选的差异基因数据表,直接进行Annotation分析。该部分实验由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.7 差异表达基因的RT-PCR验证

对基因芯片筛选出的MAPK信号通路差异表达基因Braf、Fgf7和Map2k7做RT-PCR进行验证。引物合成均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠神经元细胞培养情况

染毒48 h后,光学显微镜下观察对照组和染铝组细胞形态,可发现,对照组神经元细胞清晰,轴突较长,有较多从胞体开始向末梢逐渐变细的树突,细胞与突触间,胞体与胞体间连接丰富(见图1A)。染毒组神经元的细胞体积缩小,轴突变短,树突的数量减少,细胞与突触间,胞体与胞体间连接明显减少(见图1B)。

A.空白组 B.染铝组

2.2 小鼠神经元细胞活力

CCK-8法检测两组的细胞活力,结果显示染毒48 h后,与对照组(100%±0.00%)相比较,染铝组细胞活力(76.4%±0.02%)明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 总RNA质量鉴定

对照组及染铝组提取总RNA后,对样品进行变性琼脂糖凝胶电泳,18S和28S条带清晰可见,质检指标2100 RIN>7且28S/18S在1.8-2.0之间,结果表明样品总RNA纯度较高,未见明显降解,符合基因芯片检测要求。

2.4 基因芯片检测结果

从京都基因和基因组百科全书数据库检索到MAPK信号通路已知包含93个基因。应用Agilent小鼠全基因组表达谱芯片检测对照组和染铝组小鼠神经元细胞mRNA表达,通过对基因芯片结果中差异表达的基因进行GO分析找出与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关的基因,初步结果提示,与对照组相比较,染铝组差异表达的基因24个,其中明显上调的基因9个,明显下调的基因15个。其中包括一些关键基因,如B-Raf、Map2k7、Ras、Taok1等(见表1)。

2.5 差异表达基因的RT-PCR验证结果

选择MAPK信号通路中3个差异表达的关键基因:Braf、Fgf7和Map2k7,应用RT-PCR法验证其相对表达水平,检测结果与基因芯片检测结果相吻合(见图2)。

3 讨论

铝是一种慢性蓄积神经系统毒物,可通过血脑屏障进入脑组织,引起神经元纤维变性,进而造成神经细胞死亡和突触可塑性改变,从而引起神经行为改变。本研究结果显示,染铝组小鼠神经元细胞体积缩小,轴突变短,树突的数量减少,细胞与突触间,胞体与胞体间连接明显减少细胞活力下降,进一步证明铝对神经元细胞的毒性作用。

丝裂原活化蛋白激酶信号通路是真核细胞中一个重要的信号通路,能将细胞外刺激转导至细胞及核内,介导细胞增殖、转化及死亡。目前的研究发现,在哺乳动物体内存在的MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、ERK5、c-jun N端激酶(JNK)和p38途径4条通路[8,9]。不同的胞外刺激激活不同的MAPK信号通路。

本实验应用Agilent小鼠全基因组表达谱芯片检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路基因在铝致小鼠神经元细胞死亡过程中的表达谱变化。通过对差异表达基因进一步分析,结果提示这些差异表达基因中一些是MAPK信号通路的关键基因,如B-Raf、Rasa1、Map2k7、Taok1。B-Raf基因编码丝/苏氨酸特异激酶,这种激酶是RAS/RAF/MEK/ERK信号通路重要的转导因子[10],且Rasa1基因编码的p120-RasGAP蛋白是此信号通路的调控因子,通过细胞表面的多种受体酪氨酸激酶,调节细胞的生长、分化和增殖[11]。Taok1,即Map3k16,其编码的蛋白Map3k16是丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员,可通过磷酸化MKK3激活p38,调节核内转录因子。Map2k7编码一种双特异性蛋白激酶,这种激酶是MAPK信号通路的重要组成部分,在JNK信号转导通路中有特定的作用。Chuk编码的蛋白是丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员,它是关键转录因子NF-kappa-B复合物的抑制剂,它的磷酸化位点通过泛素化途径触发抑制剂的降解,从而激活转录因子。

表1 染铝组MAPK信号通路基因的表达变化Table 1 Differential expression of MAPK signaling pathway in Al3+exposed group

图2 三个差异表达基因的RT-PCR验证结果Figure 2 RT-PCR verification results of three differentially expressed genes

差异表达基因中除了一些MAPK信号通路的关键基因,还有一些决定MAPK信号通路信号转导、负反馈和转录控制的基因。如编码成纤维细胞生长因子的基因编码钙通道蛋白的基因(Cacna1h、Cacna2d2、Cacng4、Cacng6、Cacna2d1、Cacnb1)、编码血小板衍生生长因子的基因(Pdgfb、Pdgfra)、成纤维细胞生长因子(Fgf6、Fgf7、Fgf15、Fgf16)、编码神经营养酪氨酸激酶受体的基因Ntrk1、编码白细胞介素1的基因Il1β等,这些MAPK信号通路调节和转录因子的异常表达,造成信号传递的错误,导致细胞内不能根据外界的刺激信号做出相应的反应并产生相应的转录产物,导致相应的生物学功能丧失而引起毒性。

RAS/RAF/MEK/ERK信号通路是一种可被酪氨酸激酶受体、G蛋白偶联受体和部分细胞因子受体等激活的MAPK通路,它通过细胞膜受体将细胞外信号传递入细胞核内,从而介导细胞内特异蛋白的表达,参与调控细胞的增殖、分化、凋亡和自噬等多种功能。研究表明,成纤维细胞生长因子受体信号可以调节若干MAP激酶,包括ERK1/2,JNK和p38。活化(磷酸化)的成纤维细胞生长因子受体底物2α可结合生长因子受体结合蛋白2(Grb2)。通过Sos蛋白的补充,生长因子受体结合蛋白2进一步激活RAS-MAPK途径[12]。这些发现提示,在铝致小鼠神经元细胞死亡的过程中,MAPK信号通路通过成纤维细胞生长因子→Grb2/Sos蛋白→RAS→RAF→MEK→ERK的酶促级联反应参与其中。MAPK信号通路中的另两条通路:JNK信号通路和p38信号通路,也参与了铝致小鼠神经元细胞死亡的过程,但由于只是通路上某些基因的变化,尚不能形成完整的酶促级联反应,仍需进一步深入研究。

本实验通过应用基因芯片技术,从mRNA水平上揭示了铝致神经元细胞死亡过程中MAPK信号通路基因的表达变化,初步证实MAPK信号通路参与铝致神经元细胞死亡的病理过程,为进一步研究铝的神经毒性提供了理论基础。