隋思博，郑佩新

（吉林省药品检验所，吉林 长春 130000）

卫生部颁标准化学药品及制剂第一册WS1-07-（B）-89为1989年制定，标准比较陈旧，未对有关物质进行检测，YBH03002004是2004年批复的试行标准，其中有关物质只是针对水杨酸，而未考虑到合成工艺中其他杂质，鉴于苯酚和4-羟基间苯二甲酸二甲酯、4-羟基苯甲酸甲酯是合成中实际存在的杂质需要检测。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，Agilent1200高效液相色谱仪，Sartorius BT25S电子天平，苯酚对照品批号：1000509-200401，甲醇，超纯水等。

1.2 试验条件

以博纳艾杰尔色谱柱（Agela ASB-C18 4.6×250 mm，5 µm），以甲醇-水-冰醋酸（60：40：1）为流动相；检测波长为270 nm。流速：1.0 mL/min，柱温：35℃，进样量：20 µL，理论板数按水杨酸甲酯峰计算应不低于5000，苯酚峰与水杨酸甲酯峰的分离度应大于2.0。

1.2 溶液

精密称取0.5 g供试品，用甲醇溶解于100 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，注入液相色谱仪，记录色谱图，即得。

精密称取苯酚对照品20 mg，用甲醇溶解于200 mL量瓶中，制成每1 mL中约含0.1 mg溶液，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，再精密加入供试品溶液1 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。注入液相色谱仪。记录色谱图，即得。

1.3 测定波长的选择

取苯酚对照品溶液，在200 nm～400 nm波长范围内扫描，结果在270 nm波长处有最大吸收，供试品经DAD扫描确定270 nm下检测到的杂质峰最多，同时参考《中国药典》2010版二部水杨酸的有关物质检查项下杂质检测波长为270 nm，故将有关物质检测波长定为270 nm。

2 专属性试验

取甲醇按上述色谱条件进行测定，结果溶剂峰对主成分峰的测定无干扰。

2.1 破坏性试验

2.1.1 氧化破坏

取水杨酸甲酯（批号：120303）约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加入30%过氧化氢溶液1 mL，混匀，室温放置12小时后，放冷，加甲醇并稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主峰与杂质峰的分离度较好。

2.1.2 酸破坏

取水杨酸甲酯（批号：120303）约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加入1 mol/L盐酸溶液1 mL，混匀，室温放置12小时后，加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL中和，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主峰与杂质峰的分离度较好。

2.1.3 碱破坏

取水杨酸甲酯（批号：120303）约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，混匀，室温放置12小时后，加入1 mol/L盐酸溶液1 mL中和，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主峰与杂质峰的分离度较好。

2.1.4 加热破坏

取水杨酸甲酯（批号：120303）约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，置水浴中加热1小时后，放冷，室温放置12小时后，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主峰与杂质峰的分离度较好。

2.2 小结

经过破坏试验，新增杂质较少，表明选定方法的专属性较好，可用于水杨酸甲酯的有关物质检查。

3 线性关系考察

分别精密量取上述苯酚对照品溶液，按相同色谱条件，分别精密量取5，10，20，30，40 µL注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，以峰面积（Y）对进样浓度（X）进行线性回归，得到苯酚含量测定的回归方程，见表1。

表1 线性关系考察结果

回归方程y = 884.99x +1716.4 ，r = 0.9956，苯酚量在5.365～42.92ng 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

4 精密度试验

精密量取标准曲线项下配制的对照品溶液，进样量为21.46 ng，按上述色谱条件进行测定，连续进样6次，以峰面积计算RSD%，见表2。

表2 精密度试验结果

平均值：22500，RSD%=1.30%，结果表明仪器具有良好的精密性。

5 最小定量限和最小检出限

苯酚及水杨酸甲酯的最小检出限和最小定量限见表3。

表3 苯酚及水杨酸甲酯的最小检出限和最小定量限

6 稳定性试验

去上述供试品溶液，每间隔一定的时间，精密量取20µL注入液相色谱仪，结果见表4。主峰及杂质总量均未发生显著变化，表明24小时内供试品溶液稳定性较好。

表4 稳定性试验结果

7 限度确定

苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，应严格控制其杂质量，经检测，佛山市南海中南药化厂6批样品（近效期3批和最近生产样品3批）的苯酚含量在0.02%以内；华阴市锦前程药业过效期3批样品苯酚含量为0.02%，其他3批最近生产样品的苯酚含量超过0.02%；国内某化工厂样品的苯酚含量也超过0.02%；综合上述结果，参考中国药典2010版二部水杨酸中有关物质，将苯酚的限度定为0.02%。4-羟基间苯二甲酸二甲酯厂家提供了自己提纯得到的对照品（含量99.0%以上），12批样品经测定含量均低于0.02%，鉴于中检所无对照品不利于杂质的具体定量，故拟定标准中将其列入其他杂质中，限度规定为其他单个杂质峰面积不得大于对照品溶液中水杨酸甲酯峰峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照品溶液中水杨酸甲酯峰峰面积（1.0%），12批样品的单个杂质峰面积及总杂质峰面积和均符合规定。