王学娟

(内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000)

低温是影响植物正常生长发育的重要非生物胁迫之一，不仅限制植物的种植范围，而且还会造成作物减产和品质的下降[1]。我国大部分地区位于暖温带和亚热带，植物对低温的影响非常敏感，即便是很小的降温幅度，也会给一些植物造成直接或间接损害[2]。冷害几乎每年都会对农业生产造成巨大损失，严重时甚至会绝收[3]。低温胁迫直接抑制植物细胞内的新陈代谢和多种生理生化反应，间接引起植物细胞的渗透胁迫、氧化胁迫和其他胁迫，同时低温能使植物细胞吸水速率降低，严重时细胞内结冰导致细胞结构的破坏，这种伤害是不可逆的[4]。我国东北地区葡萄酒工业产品发展缓慢，影响其发展的主要因素是酿酒的原料不足。东北地区冬季严寒，无霜期较短，有效积温不足，一些酿酒葡萄品种很难完全成熟，如赤霞珠葡萄等。因此，选育出适应寒带地区气候条件的酿酒葡萄新品种，是我国东北寒带地区葡萄酒工业快速发展的一个重要前提条件。北冰红葡萄是国内推出的适宜酿酒的葡萄新品种，具有抗寒丰产等特点，不仅适于大面积的生产果实，也是良好的观赏植物，发展前景广阔[5]。但也有研究表明，北冰红在吉林省吉林市等地区露地越冬，植株地上部枝蔓仍会发生冻害，萌芽率仅为21.3%，造成减产[6]，因此提高葡萄的耐寒性具有现实的意义。

COR基因家族参与低温胁迫的调节。Breton等在拟南芥中首次发现并克隆出COR413基因[7]。目前已报道的家族成员有COR6.6、COR15a、COR47、COR78、COR413等[8-9]。COR413蛋白家族为植物所特有，包括定位于细胞膜上的细胞膜型冷适应蛋白COR413-PM(COR413-plasma membrane proteins)及定位于类囊体膜上的类囊模型冷适应蛋白COR413-TM(COR413-thylakoid membrane proteins)2类具有明显区别的蛋白组。研究表明，编码COR413蛋白的基因家族在拟南芥和谷类等草本植物的抗冻性形成中发挥着重要的作用[10]。本研究以耐寒性较强的北冰红葡萄为材料，利用PCR技术，获取北冰红耐寒基因VvCOR413-I2，并进行分子特征分析，以期为进一步研究VvCOR413-I2基因的转化和功能验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

选择山葡萄品种北冰红为试验材料，由河北昌黎葡萄种植园提供。大肠杆菌感受态细胞Top10，由笔者所在实验室保存。RNAiso Plus试剂盒、PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase试剂盒、Ex-Taq、pMD-19T Easy Vector，均购自TaKaRa公司。琼脂糖凝胶试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 总RNA提取和反转录cDNA

采取北冰红葡萄幼嫩叶片，按照RNAiso Plus试剂盒和PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase试剂盒说明书进行总RNA的提取和反转录cDNA的合成。

1.3 COR413-I2基因引物设计及全长克隆

通过https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html检索葡萄(Vitisvinifera)Genoscope.12X基因组中COR413基因序列，并在NCBI上检索其他植物COR413基因序列，对葡萄基因组中COR413基因序列进行Blast比对，设计特异性引物。上游引物COR413-I2-F：3′-ATGGGGAAAAAGGGTTACT-TGGCG-5′，下游引物COR413-I2-R：3′-CTATAGGAAGT-GAAGTACCAGAGCC-5′，引物由华大基因合成。

参照TaKaRa公司的Ex-Taq说明书，以cDNA为模板，利用Ex-TaqBuffer，Ex-Taq，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)和引物COR413-I2-F/COR413-I2-R扩增COR413-I2全长。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经0.1%琼脂糖凝胶电泳检测、分析、拍照后，回收目的片段，与pMD19-T Easy Vector连接，转化大肠杆菌Top10感受态，将感受态活化培养，并进行蓝白斑筛选，挑取阳性菌进行菌液PCR检测，选取3个检测为阳性的菌液送至北京华大中生科技发展有限公司进行基因测序。

1.4 生物信息学分析

利用DNAMAN、TMHMM、Blast、WOLF PSORT等生物信息学软件对该序列及其编码的氨基酸序列进行分子特征分析和结构分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取和检测

RNA提取电泳结果(图1)中可见清晰的3条条带，分别为5S、18S、28S RNA，纯度检测结果为D260 nm/D280 nm=2.10，可以进行反转录。

2.2 COR413-I2基因全长克隆及检测结果

以北冰红葡萄叶片cDNA为模板可以扩增出609 bp大小的基因片段(图2)，与葡萄基因组中COR413基因大小一致。通过对阳性菌液进行PCR检测，初步推测目的基因成功转化到大肠杆菌感受态中(图3)。

2.3 VvCOR413-I2基因及氨基酸分子特征分析

通过测序结果分析，成功克隆出VvCOR413-I2全长(图4)。该基因编码202个氨基酸残基，编码的蛋白分子量为22.6 ku，等电点值为9.88，pH值为7.0时电荷为6.88。对VvCOR413-I2编码的氨基酸序列与麻风树(Jatrophacurcas)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、可可树(Theobromacacao)、榴莲(Duriozibethinus)、橡胶(Heveabrasiliensis)等植物的氨基酸序列进行多重序列比对，发现同源性在78%以上。其中与橡胶的同源性最高，同源性为85%(图5)。系统发育树结果表明，VvCOR413-I2蛋白与上述5种植物的COR413-I2具有较近的亲缘关系(图6)。

2.4 COR413-I2蛋白的结构特性

利用NCBI的Conserved Domains功能对COR413-I2蛋白进行分析，结果显示，VvCOR413-I2编码的蛋白含有WCOR413蛋白的功能域(图7)，属于WCOR413超家族成员；运用SOPMA软件对COR413-I2蛋白二级结构预测，结果显示该蛋白存在81个α螺旋、17个β转角、43个延伸链、61个随机线圈；COR413-I2蛋白含有5个跨膜结构(图8)。

3 结论与讨论

冷害时常会使植物发生淀粉转化为糖、二氧化碳交换减少、净光合速率降低、叶绿素降解等生理机能失调的现象，从而导致作物减产甚至死亡[11]。COR413蛋白在感应到冷害胁迫信号后，通过维持植物细胞膜的稳定性来减少冷害对植物细胞的伤害， 其结构与哺乳动物的视紫质类似G蛋白偶联受体(G-proteincoupled receptor，简称GPCR)蛋白家族相似[4，12]，但二者机制是否相似或相同有待进一步研究。现在已有大量研究证明，COR413蛋白家族在植物应对冷胁迫的机制中起着重要的作用，冷胁迫下丹参、针叶福禄考等植物的COR413基因表达量明显提高[13-14]。COR413基因的异源表达结果表明，将柽柳的冷适应蛋白基因转入粳稻中，转基因粳稻的耐寒性明显高于对照组[15]， 转蜡梅COR413基因的烟草同样表现出较高的耐寒性[16]。转番茄COR413基因的烟草不仅在冷胁迫下正常生长，同时在干旱胁迫时表现出更强的适应能力[17]，表明COR413家族在响应冷胁迫的同时还可以响应干旱胁迫。本研究以耐寒葡萄品种北冰红叶片为试验材料，克隆出VvCOR413-I2基因并对该基因进行了特征分析，为分析该基因的功能及通过基因工程手段选育抗寒葡萄新品种奠定基础。