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(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

种子与胚胎发育是植物有机体发育的最初阶段，也是植物生命周期中尤为关键的环节。从种胚的形成和发育阶段入手开展研究是了解种子发育过程及机理的重要途径。众多研究表明，植物种子发育过程需要通过可溶性糖、淀粉、蛋白质等内含物质含量的变化以保证种子与胚胎的正常发育。因此研究种胚发育过程中内含物质指标的变化规律有利于了解种胚成熟的演变过程和发育机理。近年来，有关于被子植物种子形态发育过程与生理特性的研究已有许多报道[1-5]，由于裸子植物种子胚胎发育周期长、取材难度大，目前对于裸子植物种子发育过程中营养物质含量的变化研究相对较少[6-7]。红松(Pinuskoraiensis)为松科松属常绿针叶乔木，国家Ⅱ级重点保护植物，有植物界“活化石”美誉，是温带地带性顶极群落——阔叶红松林的建群种，也是我国以及东亚地区极为重要的优质珍贵用材和经济树种，红松种子富含多种营养元素，营养价值极高，具有降低血脂、胆固醇和甘油三酯的作用[8-9]。但目前红松生产过程中存在结实大小年，种子生产周期长，结实量低等问题。为深入了解红松种胚发育过程与成熟机制，以处于胚胎发育不同时期的红松种子作为研究材料，监测种胚形态发育过程的同时，分析发育过程中可溶性糖、淀粉与蛋白质含量变化；通过分析红松种胚发育过程的主要内含物质含量的动态变化，揭示种子发育过程中的生理特性和重要指标的变化规律，探讨红松种胚发育成熟的机制，为探明红松种胚发育生理过程及其分子作用机理奠定基础，为有效调控种子成熟期及种子生产提供理论依据与技术支撑，也为体胚发生过程中碳源及有机物的添加提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验地概况

试验在黑龙江省苇河林业局红松种子园进行，该区地处128°3′E，44°40′N，长白山脉与小兴安岭的中间地带。海拔300 m，无霜期130 d，年积温2 700～3 000 ℃，年平均气温3 ℃，年降水量600～800 mm，主风向冬季多西北风，夏季多东南风，森林暗棕壤，土层厚度40～80 cm，pH值在5.5～6.5之间，微酸性和中性土壤。红松初级种子园于1983年采用鹤北林业局天然红松母树林接穗，圃地嫁接，1984年定植，树高7.8～8 m，胸径20～22 cm[10]。

1.2 实验材料

红松种胚采自黑龙江省苇河红松种子园中开放授粉无性系(057)，参照Yan 等[11]的取材方法，分别采集无性系固定单株向阳中部5个球果，从2016年6月15日至8月30日每隔1周采集样品，未成熟球果采集后用冰盒在24 h内带回实验室后立即用器械去除种鳞和种皮并取出种子，选择球果中间部分健康发育的种子采用体视解剖镜(OLYMPUS SZX 7)进行种子形态学和胚胎发育时期鉴定并拍照。将分别处于原胚期、裂生多胚期、柱状胚期、子叶胚前期、子叶胚期中同一发育时期的种子取出，每个球果中各取60粒种子(包含雌配子体和合子胚)均匀混合，液氮速冻后-80 ℃保存，用于生理指标的测定。

1.3 测定方法

1.3.1 种子形态指标的测定

采用游标卡尺及电子天平分别测定红松种子长、宽、重量，其中以30粒种子为1个重复，重复3次[7,12]。

1.3.2 生理指标的测定

选取低温保存的授粉后3周(阶段1)、5周(阶段2)、7周(阶段3)、9周(阶段4)、11周(阶段5)的种子，分别测定其可溶性糖、淀粉、蛋白质含量。可溶性糖含量的提取与质量分数测定采用硫代巴比妥酸法测定[13]；可溶性淀粉含量的测定采用NBT(氮蓝四唑)光还原法进行测定[13]；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定[14]。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件和SPSS 17.0分析软件进行分析处理，用邓肯氏新复极差法(Duncan)进行显著性检验，图中数据均为3次重复平均值。

2 结果与分析

2.1 红松种胚发育进程的解析

红松种子在发育过程中，种子及胚胎的形态特征发生显著的变化(见图1)。6月下旬(授粉后3周)红松种子呈透明状，胚胎处于原胚期(图1中原胚期种子)；7月初(授粉后5周)红松种子较原胚期体积增大，种子逐渐变为不透明，原胚柄伸长并推动胚胎更深入雌配子体中，进入裂生多胚期(图1阶段2)，胚柄进一步发育的同时，溶蚀腔内同时发育多个具有胚头和胚柄的胚胎，多胚胎间竞争后保留一个优势胚胎进一步发育，其他幼胚逐渐退化解体，7月中旬(授粉后7周)红松种子变为白色，胚胎发育成为一个伸长的圆柱体，优势柱状胚的胚头变大，胚柄伸长，胚胎发育进入柱状胚期(图1阶段3)，7月底至8月初(授粉后9周)，种子大小与成熟时接近，去掉外种皮后的种子呈现不透明的乳白色，胚柄稍有退化，分化出子叶(此时多片子叶合生尚未分离)，预示着已进入子叶胚前期的发育阶段(图1阶段4)；8月中下旬(授粉后11周)，种子质地变得坚硬，乳白色基础上变为乳黄色，胚柄基本上已退化，子叶进一步发育，多片子叶先端出现分离，发育至此，红松种子及胚胎形态上发育成熟，进入成熟的子叶胚期。

图1 不同胚胎发育阶段的红松种子(上排)与合子胚(下排)形态

2.2 红松种子发育过程中形态指标的变化

红松种子发育过程中横径、纵径、重量变化情况见表1。整体来看，红松种子大小的发育先后经历了快速生长与慢速生长2个阶段。其中，原胚期至子叶胚前期(授粉后3～9周)是红松种子的快速生长阶段，期间种子纵径与横径均呈显著性增加，其中平均纵径从11.72 mm(原胚期)增加至17.73 mm(子叶前胚期)，平均横径从5.18 mm(原胚期)增加至9.18 mm(子叶前胚期)；子叶胚前期至子叶胚期种子生长速度较慢，此时种子大小趋于稳定。方差分析结果表明，除子叶胚前期与子叶胚期种子横径与纵径增加均不显著外，其余各发育时期的纵径与横径均差异显著(p<0.05)。红松种子发育过程重量变化的方差分析结果表明，发育早期(原胚期至裂生多胚期)红松种子重量增加不显著；裂生多胚期至子叶胚前期种子重量增加显著，发育至子叶胚前期种子平均重量由裂生多胚期的158.96 mg增至571.2 mg，增加了3.59倍；随后的发育过程中种子重量增加不显著(p<0.05)。

表1 红松种子生长发育的形态差异

发育时期种子纵径(mm)种子横径(mm)种子重量(mg)111.72±0.688d5.18±0.334d206.12±30.56a213.14±0.374c6.27±0.572c158.96±49.05a315.11±0.363b7.39±0.496b363.26±40.86b417.73±0.682a9.18±0.622a571.2±34.15c518.72±0.834a9.4±0.333a581.77±49.59c

注：同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.3 红松种子发育过程中可溶性糖、淀粉与蛋白质含量的变化

不同发育阶段红松种子可溶性糖、淀粉与蛋白质含量变化结果见图2。

图2 不同发育时期红松种子可溶性糖、淀粉与蛋白质含量变化

研究结果表明，红松种子发育过程中营养物质含量随着种胚形态发育的变化而发生动态变化，各自呈现不同的变化格局。在红松种子发育过程中，可溶性糖含量呈现先快速增加随后迅速降低的变化趋势。原胚期可溶性糖含量最低，质量分数为54.88 mg/g，原胚期至柱状胚期含量随种子的发育呈现逐渐递增的变化趋势，柱状胚期达到峰值(81.53 mg/g)，随后的发育过程中可溶性糖含量迅速降低，在接近成熟的子叶胚期可溶性糖质量分数回落到61.8 mg/g(FW)，接近裂生多胚期的水平。方差分析结果表明，除子叶胚期与裂生多胚期可溶性糖含量差异不显著外，各取样期可溶性糖含量均差异显著(p<0.05)。本试验结果表明，可溶性糖在红松种胚发育早期大量积累，分析其可能为种胚的形态建成与器官分化过程提供能量。

在原胚期至子叶胚前期可溶性淀粉含量呈逐渐递增的变化趋势，随后的发育淀粉含量一直维持在较高的水平。进一步方差分析结果表明，除子叶胚期与子叶胚前期含量差异不显著外，其余各时期淀粉含量均差异显著(p<0.05)，子叶胚前期与子叶胚期淀粉含量(子叶胚前期为146.42 mg/g(FW)，子叶胚期为144.9 mg/g(FW))约为原胚期含量(25.51 mg/g(FW))的5～6倍。上述结果表明淀粉在红松种胚发育晚期迅速积累，在种胚发育晚期淀粉维持较高的水平可为种子后期的进一步成熟与脱水过程奠定基础。

本试验研究中可溶性蛋白质含量变化趋势与淀粉类似，但在整个发育过程中蛋白含量均维持在较低的水平，原胚期至子叶胚前期含量逐渐增加，蛋白质合成速度逐渐加快；随后的发育过程中含量趋于稳定，子叶胚前期蛋白质含量为7.37 mg/g，子叶胚期为7.33 mg/g。方差分析结果表明，除子叶胚期与子叶胚前期蛋白质含量差异不显著外，其余各时期含量均差异显著(p<0.05)。上述结果表明，蛋白质含量随着种胚的发育成熟逐渐增加，发育至子叶胚前期蛋白质合成速度降低，致使子叶胚前期与子叶胚期蛋白质含量达到峰值并趋于稳定。在紫荆(Cercischinensis)种子成熟过程的研究中也发现在种子发育后期贮藏类物质积累，与本研究结果类似[15]。

3 结论与讨论

种子与胚胎的发育是红松生殖生长中最为关键的环节。本研究通过红松种子发育过程的解析发现其种胚发育遵循松属的种胚发育特征，其外部形态变化明显，胚胎发育从受精卵开始先后经历原胚期、裂生多胚期、柱状胚期、子叶胚前期、子叶胚期等几个发育阶段[16-18]。原胚期至子叶胚前期是红松种胚生长发育的高峰期，子叶胚前期的种子纵径与横径最大，裂生多胚期至子叶胚前期种子重量显著增加。上述红松种子纵径、横径、鲜重变化规律与百子莲(Agapanthuspraecox)[1]、棕榈(Trachycarpusfortunei)[4]、牡丹(Paeoniasufruticosa)[5]等植物的种子发育情况相似。

植物种子发育过程需要通过可溶性糖、淀粉、蛋白质等内含物质含量的变化以保证种子与胚胎的正常发育[19]。种胚的生长发育是一个需要能量的过程，可溶性糖是生物体生命活动能量的源泉，可为种胚生长发育提供营养物质和能量[20]，参与发育后期营养物质储存积累[21-23]，也作为关键的发育信号调控种子发育早期细胞分裂和扩增等过程[24]。在本研究中可溶性总糖含量呈先升后降的变化趋势，峰值出现在柱状胚期的种子中。据此分析在红松种胚发育早期，细胞处于旺盛的分裂和分化阶段，可溶性糖含量迅速积累，以满足发育早期较高的能量需求来维持种胚正常的生长发育。而在种子发育后期，可溶性糖用于蛋白质和油脂等储存物质合成因而质量分数呈下降的变化趋势。

本研究中，可溶性淀粉含量在红松种子发育前期与中期(阶段1～4)呈逐渐递增的变化趋势，接近成熟期的种子中其含量维持在较高的水平并趋于稳定，由此可见，红松种子的发育表现为淀粉沉积的过程，与谷类作物的种子发育类似[25]。可见在种子发育初期淀粉积累量少，转化成总糖的也少，随着种子的发育淀粉含量不断增加，子叶胚前期开始逐渐加大积累量，直至子叶胚期一直维持在较高的水平。

蛋白质是种子发育过程所需氮素营养的重要来源，蛋白质的合成为种子与胚胎的正常发育奠定物质基础。种子可溶性蛋白多为参与代谢活动的酶类，其含量的高低可间接反映植物体内物质代谢的强弱，因此常被作为评价植物代谢的重要生理指标[26,7]。本研究中可溶性蛋白含量与淀粉变化趋势近似，随着种子的发育逐渐加大蛋白质的积累量，这与板栗(Castaneamollissima)种子发育过程中蛋白质含量变化趋势一致[27]。由此可见，在红松种胚后期的成熟过程中，需要有大量的蛋白质参与，作为活跃的生理生化活性物质参与细胞代谢过程，为种胚的继续生长发育提供养分，此外，蛋白质也作为红松种胚形态建成的结构组成物质发挥作用。

本研究在监测红松种胚发育形态演变过程的同时，对几种生理指标的变化规律进行了初步的探讨。研究结果表明，在红松种胚发育早期可溶性糖大量积累，为种胚的发育提供能量，而可溶性淀粉与蛋白的大量积累则发生在种子发育后期。本研究结果证实了红松种胚发育过程中可溶性糖、淀粉与蛋白质含量的变化与其发育状态密切相关，几种营养物质共同参与调控红松种胚的生长发育。研究结果在一定程度上揭示了营养物质在红松种胚发育过程中的表达模式，可为红松及其他针叶树种胚发育的研究奠定基础，同时为种子园经营管理提供参考。此外，发育过程中生理指标变化规律也可为体胚发生过程中碳源及有机物的添加提供理论依据。