陈晶晶， 王英哲， 金 艳， 周 仂， 徐 博*

(1. 吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春130118； 2. 吉林省农业科学院， 吉林 长春130033)

随着我国经济科技的迅猛发展，环境污染问题日益严重，而重金属污染是当今面积最广、危害最大的环境问题之一，当植物体内重金属过量积累或超过临界值时，会对植物的生长发育和代谢产生消极影响[1-3]。紫花苜蓿(MedicagosativeL.)作为一种优质的多年生豆科牧草，在畜牧业中有着举足轻重的地位。重金属铅对紫花苜蓿的污染也是不可避免的，当铅在紫花苜蓿体内过量积累时会导致铅在动物和人的体内富集，从而对人体产生危害。本试验以不育系MS-GN为母本，14个不同的父本构建的杂交组合F1代种子为材料，研究在不同浓度硝酸铅溶液处理下的杂交组合F1幼苗的生理指标变化，分析铅胁迫对生理指标产生的影响，以期找到在铅胁迫下耐受性更强的紫花苜蓿杂交组合，为紫花苜蓿耐铅品种选育提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

本研究以14个不同品种的紫花苜蓿为父本、不育系MS-GN为母本构建的杂交组合F1代为研究材料，供试材料均由吉林省农业科学院提供。父本来源见表1。

挑选籽粒饱满的杂交组合种子播种于盛有灭菌营养土的花盆中，花盆高15 cm，口径10 cm，每盆播种6粒种子，每个杂交组合播种18盆。做好标记后移至HPG-400HX人工气候箱培养40天(光照12 000 lx，15 h，温度25℃、湿度75%；无光照，9 h，温度20℃、湿度75%)。配制不同浓度(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1，200 mmol·L-1，300 mmol·L-1)的硝酸铅[Pb(NO3)2]溶液，每个杂交组合3盆为1组，共分为5个处理组和1个对照组。处理组每盆浇灌5 mL相应浓度的Pb(NO3)2溶液，对照组喷施相同体积的蒸馏水，每3 d处理1次，共处理3次，每次处理后均放回原培养箱培养，9 d后测定各项生理指标：可溶性蛋白(soluble protein,SP)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)。

表1 紫花苜蓿杂交组合父本来源Table 1 The source of alfalfa hybrid combinations

1.2 指标测定及方法

1.2.1植物组织液的提取 称取0.1500 g幼苗的新鲜叶片剪碎，加入0.05 mol·L-1，pH=7.8的磷酸缓冲液1.5 ml及少量的石英砂于研钵中研磨，移至2 ml离心管中，5 000 r·min-1，4℃下离心10 min，取上清液，用于指标测定[4]。

1.2.2生理指标的测定 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[4]，SS含量采用蒽酮比色法测定[4]，SP含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，CAT活性采用可见光法测定[4]。

1.3 数据处理

试验所得数据均采用Excel 2013，SPSS 18.0统计软件进行数学统计分析。

1.4 综合评价方法

采用Fuzzy数学中隶属函数法进行综合评判[5]。

与耐受性呈正相关的参数SP、SS、CAT采用公式1：

(1)

与耐受性呈负相关的参数MDA采用公式2:

(2)

式中：Xijk表示第i个品种第j个处理下的第k个指标的测定值；U(Xijk)表示第i个品种第j个处理下的第k个指标的隶属度，且U(Xijk)∈[0,1]；XMIN，XMAX表示测定值中的最小值和最大值。

2 结果

2.1 SP含量的变化

不同浓度硝酸铅溶液处理下各个杂交组合幼苗中的SP含量变化结果如表2所示。

表2 不同处理对SP含量的影响Table2 Effects of different treatments on soluble protein contents

注：不同字母表示同一杂交组合不同处理间差异显著(P<0.05)，下同

Note:Different letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2 SS含量变化

铅胁迫处理下各个杂交组合幼苗中的SS含量变化结果如表3所示。

2.3 MDA含量的变化

不同浓度硝酸铅溶液对杂交组合幼苗处理后的MDA含量变化结果如表4所示。

表3 不同处理对SS含量的影响Table 3 Effects of different treatments on soluble sugar contents

表4 不同处理下对MDA含量的影响Table 4 Effects of different treatments on MDA contents

2.4 CAT活性的变化

本研究结果表明在经过Pb处理后2×M，4×M，5×M，7×M，8×M，11×M，15×M杂交组合CAT活性升高，结果数据见表5。

2.5 综合评价

紫花苜蓿对重金属Pb的耐受性与多个指标均相关，使用隶属函数法做综合评价(表6)。各杂交组合的耐受性按大小排序：11×M>8×M>3×M>1×M>7×M>9×M>6×M>2×M>5×M>10×M>4×M>13×M>14×M>12×M。

表6 隶属函数值Table 6 Subordinate function values

3 结论与讨论

植物在遇到干旱、寒冷、冻害、盐碱胁迫时可通过增加体内渗透调节物质来抵御外界不良环境的影响，以保障自身正常的生长发育。同样的，紫花苜蓿杂交组合的幼苗在吸收了土壤中的铅后通过积累体内渗透调节物质，即可溶性蛋白、可溶性糖以及丙二醛，减轻铅对幼苗产生的不良影响。

SP大多以酶的形式参与植物体的代谢过程[6]，测定SP在铅胁迫时含量变化亦可作为了解紫花苜蓿体内总代谢的重要指标。如表2结果所示，随着硝酸铅溶液浓度的变化SP含量的变化幅度较小，但总体上各杂交组合在不同处理下的SP含量变化呈上升趋势，2×M，3×M，5×M，7×M，9×M，10×M，11×M，14×M杂交组合的SP含量在经过各个浓度铅溶液处理后均有所升高。说明这些杂交组合幼苗在遭受不良环境的胁迫时体内代谢活动旺盛，酶的含量升高。

SS的含量影响植物体内总溶质浓度的变化，植物在逆境下积累更多的可溶性糖，增加细胞浓度，从而增强抗逆性[7]。本研究中，各杂交组合幼苗体内可溶性糖的含量经过不同浓度的硝酸铅溶液处理后均高于对照组，这表明当植物遇到外界逆境胁迫时，会通过增加体内SS含量，增强抗逆性。

MDA是植物在逆境胁迫下对细胞膜脂质过氧化水平的一种反应[8]。由表3结果可知，随着铅溶液浓度的升高，3×M，4×M，5×M，6×M，7×M，8×M，9×M，11×M，12×M，14×M杂交组合体内的MDA均升高，说明此时幼苗体内质膜过氧化程度降低。铅胁迫导致杂交组合幼苗体内MDA的积累从而降低了质膜过氧化水平，表现出对重金属铅的抗逆性，这与孙刚[9]、王敏[10]的研究结果一致。

CAT作为重要的酶促清除系统，在清除植物体内过氧化氢、维持氧自由基平衡、减轻逆境对植物的损害等方面具有重要作用[10]。表4结果表明在经过硝酸铅溶液处理后2×M杂交组合在50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，200 mmol·L-1，300 mmol·L-1的硝酸铅溶液处理下CAT活性显著高于对照组，4×M杂交组合在150 mmol·L-1，200 mmol·L-1的硝酸铅溶液处理下CAT活性显著高于对照组，8×M杂交组合CAT含量虽然在150 mmol·L-1，200 mmol·L-1的硝酸铅溶液处理下有所升高，但增幅不显著。11×M杂交组合在200 mmol·L-1，300 mmol·L-1处理下的CAT活性升高但不显著，12×M的CAT活性在150 mmol·L-1的处理下显著升高。说明经过硝酸铅溶液处理后的幼苗通过增加体内CAT活性，加速清除体内活性氧，提升自身的抗逆境能力。而其余杂交组合CAT活性却有所降低，原因可能是由于父本不同，导致杂交组合之间在耐受性存在差异，铅胁迫可能抑制其余杂交组合体内CAT的活性。

综合14个杂交组合F1代在不同浓度的硝酸铅溶液处理后各项生理指标的隶属函数值，求得平均值，按大小排序：11×M>8×M>3×M>1×M>7×M>9×M>6×M>2×M>5×M>10×M>4×M>13×M>14×M>12×M。综合评价的结果与单一指标的结果略有出入，说明了在评价植物耐铅性时，不宜选择单一指标作为评价依据，应综合考虑多个指标的共同作用。