张 雪，刘国东，林 群，方 强，谢 坤，赵义军，刘付宝

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是一种起源于胆管上皮细胞的致命恶性肿瘤[1]。该肿瘤在美国每年的发病人数在1 300～3 000例之间[2]。慢性炎症性病症被认为是肝内胆管癌的诱因因素[3]。由于早期无明显的症状、体检尚未普及等原因致ICC明确诊断通常较晚，手术是目前最好的治疗方式，术后5年生存率约20%～50%[4]。X染色体耦联的锌指蛋白(X-linked zinc finger protein,ZFX)位于X染色体，编码krueppel C2H2型锌指蛋白家族成员[5]。在胚胎细胞和成人造血干细胞具有重要的转录调解作用[6]。研究[7]证明ZFX的过表达与胆囊癌等多种肿瘤的发生发展均有密不可分的关系。ZFX在肝内胆管癌中的作用尚不明确，目前国内外未见相关文献报道。该实验运用siRNA沉默肝内胆管癌细胞的ZFX的表达，观察其对细胞生物学性质的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与siRNA核苷酸片段的合成 选取人胆管细胞型肝癌细胞株(cholangiocarcinoma cells,HCCC-9810)作为实验对象，由上海交通大学新华医院馈赠；siRNA由上海汉恒生物科技公司合成；siRNA序列:5′-GTCGGAAATTGATCCTTGTAA-3′；Scr-siRNA序列: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。使用前按说明书用DEPC水稀释至需要浓度。

1.1.2主要试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；lipofectamine 3000试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；TRIzol裂解液购自美国Invitrogen公司；PCR反转录试剂盒购自上海Promega公司；兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶人抗兔IgG二抗购自美国Genetex公司；CCK-8增殖试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HCCC-9810细胞用含15%胎牛血清、100 U/ml青霉素链霉素抗生素的RPMI 1640培养基于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.2.2细胞转染 转染前1 d调整细胞浓度至覆盖率约60%,并用不含抗生素的新鲜培养基培养，实验分组分别为Cell组(未转染siRNA的HCCC-9810细胞组)、NC-siRNA组(转入negative control的细胞组)、ZFX-siRNA组(转入ZFX的细胞组)。转染方法严格按照lipofectamine 3000的操作说明进行，5 h后更换为RPMI-1640普通培养基。

1.2.3RT-PCR检测各组转染后ZFX的mRNA表达水平 转染48 h后收集细胞，使用TRIzol(Invitrogen公司)试剂提取RNA，严格按照操作说明进行，检测各组RNA总量，然后按照说明书使用反转录酶、Oligo dT(Promega)反转录为cDNA，进行RT-PCR反应，GAPDH作为内参，GAPDH引物序列为：正义链：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′; 反义链：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；ZFX 引物序列为：正义链 5′-GGCAGTCCACAGCAAGAAC-3′；反义链：5′-TTGGTATCCGAGAAAGTCAGAAG-3′，以2-ΔΔt计算各组ZFX基因mRNA的表达量，每组各实验3次。

1.2.4Western blot检测 将转染后的各组细胞离心后，PBS洗涤3次，离心弃上清液，加入RIPA裂解液30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液。SDS-PAGE凝胶电泳转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，孵育兔抗人多克隆抗体(1 ∶1 000)摇床慢摇2 h，TBST慢摇清洗3次，每次5 min，二抗室温孵育2 h，于暗室滴加ECL，覆盖X线片曝光，显影，拍照，保存。

1.2.5克隆形成实验 24孔板内培养HCCC-9810细胞，覆盖率达70%后siRNA转染，每组设置3个复孔，3 d后收集各组转染成功的细胞，各组对应六孔板内铺约400个细胞，充分摇匀并显微镜下观察至无细胞聚集，每2 d更换细胞培养基，培养至2周后4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色20 min，显微镜下随机抽取5个视野，分别统计每孔内>50及<50个细胞的克隆细胞集落数并分析结果。

1.2.6CCK-8法检测细胞增殖实验 持续增殖能力是癌细胞最基本的能力。设置实验组、空白对照组及阴性对照组，每组3个复孔，取对数生长期的细胞，分别接种于96孔板内，每孔加入2×104/100 μl培养基，转染后每间隔24 h加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后，酶标仪测定595 nm处各孔的吸收值。

1.2.7Transwell迁徙、转移实验 24孔板transwell chamber(0.8 μm，美国Cornning公司)，收集各组siRNA转染后的细胞，上室内加入200 μl不含血清的细胞培养液，下室内加入600 μl含15%FBS的培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中自然迁移条件下培养24 h后甲醛固定10 min，结晶紫染色10 min，棉签拭去上室内细胞，显微镜下随机选取5个视野观察转移至下室内的细胞并拍照、计数。转移实验需每室内加入37 ℃培养基200 μl 水化胶，培养48 h后固定染色，其他同迁徙实验。

2 结果

2.1siRNA对HCCC-9810细胞ZFXmRNA表达水平的影响转染48 h后，RT-PCR结果显示：Cell组与NC-siRNA组之间mRNA表达水平未见明显差异，ZFX-siRNA组mRNA表达水平与Cell组、siRNA-NC组相比下降明显(P<0.01)，见图1。

图1 沉默ZFX基因对HCCC-9810细胞ZFX mRNA表达水平的影响

2.2siRNA转染HCCC-9810细胞后ZFX蛋白的表达Western blot 检测结果与RT-PCR结果相一致，Cell组与NC-siRNA组之间比较，ZFX基因表达水平未见明显改变，ZFX-siRNA组蛋白表达水平与Cell组、NC-siRNA组相比下降明显，RT-PCR和Western blot均证实ZFX-siRNA使HCCC-9810细胞的ZFX基因表达下调明显。见图2。

图2 siRNA转染HCCC-9810细胞后蛋白印迹图

2.3沉默ZFX对胆管癌细胞克隆形成的影响结果显示siRNA-ZFX实验组的小克隆(<50)细胞集落明显多于Cell组及NC-siRNA组。显微镜下观察结果：Cell组、NC-siRNA组之间形成克隆数、克隆形成率未见明显差异(图3B)，ZFX-siRNA组与NC-siRNA组相比每个克隆所包含的细胞数目明显减少(t=3.188，P=0.0333)，各组重复3次，有轻度差异，但无统计学意义。该实验结果表明敲低ZFX对于肝内胆管癌细胞的克隆形成能力具有重要的影响。见图3。

图3 沉默ZFX对胆管癌细胞克隆形成的影响

A：每个孔内的克隆图片；B：每个孔内的克隆数统计结果；与NC-siRNA组比较：*P<0.05

2.4CCK-8检测结果ZFX-siRNA组细胞增殖能力明显弱于NC-siRNA组(F=150.3,P<0.01)及Cell组(F=151.5,P<0.01)，且随着时间推移差异逐渐变大(图4)，Cell组与siRNA-NC组之间及各组组内之间差异无统计学意义。结果表明敲低ZFX表达对肝内胆管癌细胞的增殖能力具有重要的影响。

图4 沉默ZFX基因对HCCC-9810细胞增殖能力的影响

2.5沉默ZFX对肝内胆管癌细胞迁徙、侵袭的影响通过siRNA下调HCCC-9810细胞中ZFX基因后，能够显著抑制细胞的迁移及侵袭能力(图5)，siRNA-ZFX组与siRNA-NC(t=8.505P=0.001)组相比可见转移到下室的细胞数明显减少，而Cell组与siRNA-NC组之间差异无统计学意义。图6显示，siRNA-ZFX组与siRNA-NC(t=8.311，P=0.002)组相比可见转移到下室的细胞数明显减少，而Cell组及siRNA-NC组之间差异无统计学意义。

图5 沉默ZFX基因对HCCC-9810细胞迁移的影响 结晶紫染色×40 与NC-siRNA组比较： **P<0.01

图6 沉默ZFX 基因对HCCC-9810细胞转移的影响 ×40 结晶紫染色

3 讨论

近年来，恶性肿瘤成为威胁人类健康的重要原因之一，ICC是当今人类危害最大的恶性肿瘤之一，我国ICC发病率增值迅速，多数学者把研究重点放在该肿瘤的治疗上，对于该肿瘤的发生、发展的机制及重要影响的关注力度明显不够，不能从根本上解决ICC的治疗问题。原发性肝癌分为肝细胞性肝癌、胆管细胞性肝癌和混合型肝癌，在原发性肝癌中，胆管细胞性肝癌的发生率仅次于肝细胞性肝癌[8]，目前有早期症状不明显、早期诊断困难、恶性程度较高等特点，致胆管细胞癌明确诊断时常属于晚期，且该肿瘤容易向周围血管及组织浸润，致外科手术切除困难，胆管细胞癌放疗、化疗敏感性较低[9]，因此对胆管细胞癌的发生、发展的机制研究成为目前目标之一。深入研究ICC发生的分子机制，寻求新的诊断及治疗方法是提高ICC整体疗效的关键。锌指蛋白是指含有稳定的短的能与Zn2+结合的自我折叠形成手指结构的一类蛋白质，锌指蛋白可以特异的与靶结构结合从而发生特定的影响。近期，国内外相关研究[10-12]表明ZFX在鼻咽癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、发展及预后具有密不可分的关系，同时，参与多种肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡等多个过程[13-15]，而国内外尚未见该蛋白在ICC中的生物学作用的报道。本文旨在探讨ZFX在ICC细胞中的生物学功能。

恶性肿瘤的恶性程度与肿瘤细胞的增殖、转移、克隆等能力具有密不可分的关系，而ICC具有很强的早期转移力、侵袭力强及预后差等特点，因此对于与肝内胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭及克隆能力等有影响的基因的研究成为早期诊断及靶向治疗的研究方向。siRNA干扰技术是将与目的基因同源的双链RNA转染入细胞中，使与其对应的mRNA降解，从而实现目的基因序列沉默[16]。本实验通过对ZFX基因特异靶点的siRNA及一条阴性对照siRNA，通过lipofectamine 3000分别转入相对应的实验组HCCC-9810细胞系中，并通过RT-PCR、Western blot从mRNA、蛋白水平检测ZFX基因的表达水平，并为后续实验提供基础。本研究通过CCK-8增殖实验、Transwell迁移、侵袭及克隆形成实验证明ZFX基因表达的敲低导致肝内胆管癌细胞的增殖、转移、侵袭及克隆能力明显下调，表明ZFX在HCCC-9810细胞系的生长、转移等过程中扮演着促进的角色。

尽管研究证明ZFX沉默对肝内胆管癌细胞的生物学功能具有重要影响，但具体机制尚不清楚，相关研究[17]表明在非小细胞肺癌中，miR-144过表达与ZFX的沉默能够显著抑制细胞的增殖且能诱导细胞凋亡，进一步研究表明ZFX的表达水平可通过miR-144调节，同时，ZFX的异常表达显著降低miR-144对肿瘤发生发展的抑制作用，表明干扰miR-144-ZFX通路或许对多种肿瘤的发生、发展具有重要影响。Akt、ERK1/2作为ZFX调节细胞功能的重要通路，NSCLC[18]、 LSCC[19]、 乳腺癌[20]和胃癌[13]中均会降低Akt、ERK1/2磷酸化作用。目前，国内外尚未见关于ZFX基因在ICC患者细胞中表达水平的检测、与肿瘤恶性程度及预后的关系及miR-144、Akt、ERK1/2在ZFX调节ICC的通路中扮演的角色的报道，为深入探索ZFX在临床上的功能的作用及具体机制的研究进一步证明ZFX在ICC的发生、发展中的作用提供理论方向。

综上，降低ZFX在ICC细胞中的表达抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移及转移能力，持续对于ZFX在肝内胆管癌中的具体分子机制的研究将有助于进一步了解ICC的发生、发展，为胆管细胞癌的早期诊断及分子靶向治疗提供依据。