李晓娟，史颖，杨筱凤

(1.陕西中医药大学第二附属医院妇科二区，陕西 西安 712000;2.西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061)

宫颈癌的发生与发展是一个由量变到质变的累积过程，历经了宫颈炎-宫颈上皮内瘤变(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)-宫颈癌的递进式病变，持续性的高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是发展至宫颈癌的先决条件[1]。流行病学调查结果显示这个过程具有可逆性，CINⅠ的自然消退率达到90%以上，CINⅡ约为45%～65%，CIN Ⅲ只有25%～35%，发展至宫颈癌中晚期，患者的5年生存率仅有10%左右[2]。因此，将疾病控制在早期阶段是增加治愈率、延长患者生存期的一个重要方向。在抗肿瘤治疗中，免疫机制受到越来越多的重视，免疫系统是人体内自然存在的抗肿瘤机制，近几年较受重视的是CD4+T细胞和肿瘤相关巨噬细胞。CD4+T细胞也称辅助性T细胞(Th细胞)，其中Th1/Th2、Th17/CD4+CD25+Treg两大平衡体系在病原体与肿瘤免疫中均起了重要作用。当前研究已证实[3-4]，Th17/CD4+CD25+Treg平衡与肿瘤相关巨噬细胞均参与了宫颈癌的病理机制，本研究观察吉西他滨对宫颈癌患者外周血肿瘤相关巨噬细胞及Th17/CD4+CD25+Treg的影响，为完善其药理机制提供数据支撑。

1 资料与方法

1.1一般资料研究对象为陕西中医药大学第二附属医院2014年12月至2016年12月收治的59例宫颈癌患者，年龄(48.5±13.4)岁，年龄范围为37～63岁。纳入标准：(1)首次确诊为宫颈癌，且有确切的组织学诊断依据证实为宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅰb2～Ⅱb期；(2)拟行根治术治疗；(3)人乳头瘤病毒(HPV)阳性；(4)美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分0～2分。排除标准：(1)妊娠期与哺乳期；(2)既往有放化疗治疗史；(3)近3个月有激素或免疫治疗史；(4)合并有传染性疾病或其他感染性疾病；(5)糖尿病；(6)免疫系统合并症等。本研究经陕西中医药大学第二附属医院伦理委员会批准，所有患者均自愿签署知情同意书。采用随机数字表法将患者分为观察组(30例)和对照1组(29例)，一般资料比较如表1所示，差异无统计学意义(P>0.05)。另取11例同期入院体检者作为外周血对照(对照2组)，年龄(48.3±10.1)岁，年龄范围为38～60岁。

表1 两组一般资料的比较

1.2治疗方法两组患者均先给予三维适形放疗，患者仰卧位，先以CT扫描确立放疗范围，自第三腰椎上缘扫描至阴道外口下5 cm，基本可确定肿瘤位置与体积，并勾画出计划靶体积(PTV)。采用6 m V-X射线照射，按照7野照射方式(即0°、52°、104°、156°、204°、256°、308°七个角度)照射。单次剂量1.8～2.0 Gy，每周5次，总剂量55～65 Gy。观察组在三维适形放疗的基础上再给予注射用盐酸吉西他滨(齐鲁制药，批号AAED8009A)新辅助化疗，用量为800 mg·m-2，第1天和第8天给药，予三维适形放疗同时进行。三维适形放疗和新辅助化疗之后，所有患者行广泛性子宫切除加盆腔淋巴结清扫术。

1.3方法

1.3.1流式细胞法测定Th17与CD4+CD25+Treg的外周血细胞计数 对照2组患者于入院体检时，宫颈癌患者于治疗前1 d、治疗后1周采用流式细胞仪测定外周血单个核细胞Th17与CD4+CD25+Treg细胞比例。主要步骤：(1)受试者者均于清晨8：00点取空腹肘静脉血2～3 mL，肝素抗凝，取血器和离心管均以肝素润洗。加入等体积Hank’s液，充分混匀，再加入适量淋巴细胞分离液，2 000 r·min-1低速离心18 min，离心半径为6 cm；(2)离心后管中液体分为三层，自上而下分别为血浆、淋巴细胞、红细胞与粒细胞的混合体，在血浆和淋巴细胞之间有一层白色的云雾带，为单个核细胞富集区；(3)以毛细管吸取单个核细胞，采用5倍体积Hank’s液重悬与洗涤、1 500 r·min-1低速离心10 min，离心半径6 cm，重复1次；(4)所得单个核细胞制成1×106个/100 μL的混悬液，先后以佛波酯与离子霉素刺激，上机检测;(5)流式细胞仪购自德国贝克曼库尔特公司，型号CytoFLEX，Th17细胞以CD4-FITC抗体与IL-17-PE抗体标记；CD4+CD25+Treg细胞以CD4-FITC抗体、CD25-APC抗体及Foxp3-PE抗体标记。

1.3.2酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Th17与CD4+CD25+Treg细胞因子的血清水平 于治疗前1 d、治疗后1周采用ELISA实验测定相关细胞因子白细胞介素-17A(IL-17A)、白细胞介素-17F(IL-17F)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平。主要步骤：(1)受试者者均于清晨8：00点取空腹肘静脉血2～3 mL，不抗凝，常温静置1 h，4 000 r·min-1离心10 min获得血清，离心半径6 cm；(2)采用全自动生化分析仪(德国贝克曼库尔特AU5800)和ELISA试剂盒测定IL-17A、IL-17F、IL-10、TGF-β1水平的血清水平，本次使用的试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3.3免疫组织化学实验测定肿瘤相关巨噬细胞表达 术中留取病理组织以及周边健康组织(距离病理组织2 cm以上)，采用免疫组织化学实验法测定肿瘤相关巨噬细胞表达。主要步骤：(1)制备石蜡病理切片。术中留取的组织切成1 cm3小块浸泡于4.0%多聚甲醛溶液，制备石蜡病理切片，厚度5～7 μm。(2)脱蜡至水。二甲苯脱蜡，3 min×2次，梯度乙醇脱苯至水，3% H2O2处理10 min阻断内源性过氧化酶活性。(3)抗原热修复。载玻片置于载玻片架，载玻片架置于大烧杯，大烧杯倒满枸橼酸缓冲液，微波炉中高火10～15 min，自然冷却至室温，连续2次。(4)抗体孵育。滴加一抗(Abcam，批号GR140316-2)，浓度为1∶200，4 ℃孵育过夜；磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液清洗，5 min×3次，滴加二抗(Abcam，批号GR140221-1)，37 ℃孵育60 min，浓度为1∶1 000。(5)二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，反蓝后中性树胶封片，镜下观察。染成黄色或棕黄色者为阳性，Image-Pro Plus分析阳性强度。

2 结果

2.1Th17与CD4+CD25+Treg的外周血细胞计数治疗前，对照1组和观察组患者的Th17细胞计数均低于对照2组，CD4+CD25+Treg细胞计数均高于对照2组，且对照1组和观察组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，对照1组和观察组的Th17细胞有所增多，CD4+CD25+Treg细胞有所减少，Th17/CD4+CD25+Treg增大，且观察组变化幅度高于对照1组，两组间比较均差异有统计学意义(P<0.05)，见图1和图2。

2.2Th17与CD4+CD25+Treg细胞因子的血清水平治疗前，对照1组和观察组患者的血清IL-17A、IL-17F、IL-10及TGF-β1比较均差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，对照1组和观察组IL-17A与IL-17F水平有所升高，IL-10与TGF-β1水平有所降低，且观察组变化幅度大于对照1组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.3肿瘤相关巨噬细胞表达两组病灶组织的肿瘤相关巨噬细胞表达量均高于健康组织，两组健康组织的肿瘤相关巨噬细胞表达量差异无统计学意义(P>0.05)；观察组病灶组织肿瘤相关巨噬细胞表达量高于对照1组，组间比较均差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨论

随着我国老龄化趋势的加剧以及普查力度的加强，宫颈癌的检出率越来越高，且呈现出一定程度的年轻化趋势。吉西他滨是一种人工合成的新型的胞嘧啶核苷衍生物，1996年正式批准上市，对大多数实体瘤有确切效果，是晚期胰腺癌的一线治疗药物，宫颈癌的二线治疗药物。其主要作用机制是进入人体后，经酶催化转化为活性代谢物二磷酸核苷和三磷酸核苷，两者可抑制核糖核苷酸还原酶，从而抑制DNA 合成[5]。此外，临床实践证实吉西他滨还是一种放射增敏剂，与放射疗法合用可起到协同作用，增强抑瘤效果[6]。在宫颈癌的病理机制中，Th17/CD4+CD25+Treg平衡与肿瘤相关巨噬细胞发挥了重要作用，本研究观察了吉西他滨对宫颈癌Th17/CD4+CD25+Treg平衡与肿瘤相关巨噬细胞的影响，以完善其药理机制，为其临床应用提供数据支撑。

注：A为对照2组；B为对照1组治疗前；C为观察组治疗前；D为对照1组治疗后；E为观察组治疗后；F为柱状统计图，与对照2组治疗前相比，aP<0.05，与观察组治疗后相比，bP<0.05,与同组治疗前相比，cP<0.05图1 三组患者治疗前后外周血Th17细胞比例的比较

注：A为对照2组；B为对照1组治疗前；C为观察组治疗前；D为对照1组治疗后；E为观察组治疗后；F为柱状统计图，与对照2组治疗前相比，aP<0.05,与观察组治疗后相比，bP<0.05，与同组治疗前相比，cP<0.05图2 三组患者治疗前后外周血CD4+CD25+Treg细胞比例比较

注： A为IL-17A；B.IL-17F；C为IL-10；D为TGF-β1；与对照2组治疗前相比，aP<0.05；与观察组治疗后相比，bP<0.05；与同组治疗前相比，cP<0.05图3 三组患者治疗前后Th17与CD4+CD25+Treg细胞因子的血清水平比较

研究结果显示，就Th17/CD4+CD25+Treg平衡而言，治疗前观察组和对照1组患者的Th17细胞计数、CD4+CD25+Treg细胞计数及Th17/CD4+CD25+Treg均差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组Th17细胞增多，CD4+CD25+Treg细胞减少，Th17/CD4+CD25+Treg增大，且观察组变化幅度大于对照1组。Th17/CD4+CD25+Treg平衡体系和Th1/Th2平衡体系是目前已经发现的CD4+T细胞最主要的两大体系[7]，在肿瘤生长和HPV感染的过程中，Th17细胞主要起免疫激动作用，诱导细胞免疫发挥活性，清除HPV和杀死肿瘤细胞[8]。而CD4+CD25+Treg细胞则主要起免疫抑制作用，其生理功能在于防止免疫反应过激造成的自体性损伤[9]。有研究证实[10]，肿瘤细胞也能产生TGF-β1，诱导生成大量CD4+CD25+Treg细胞，从而削弱细胞免疫反应对肿瘤的识别与清除能力，这也是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。因此，可以说Th17/CD4+CD25+Treg升高意味着机体对肿瘤清除能力的增强，反之，意味着机体对肿瘤清除能力的衰退。既往已有研究证实，宫颈癌患者存在Th17/CD4+CD25+Treg漂移现象，Th17细胞计数减少，细胞因子受到抑制，与此同时CD4+CD25+Treg细胞增多，细胞因子大量分泌。Th17细胞的主要细胞因子为IL-17，含A～F六种亚型，血清学研究一般考察IL-17A与IL-17F，因两者均为水溶性，血清含量丰富[11]。CD4+CD25+Treg细胞无特异性的细胞因子，可大量分泌TGF-β1与IL-10，且CD4+CD25+Treg细胞的形成也需要这两者的诱导[12]，因此本研究在考察Th17/CD4+CD25+Treg细胞计数比的同时，也考察了IL-17A、IL-17F、IL-10及TGF-β1。结果显示，治疗前两组患者的血清细胞因子水平差异无统计学意义；治疗后，两组IL-17A与IL-17F水平有所升高，IL-10与TGF-β1水平有所降低，且观察组变化幅度高于对照1组。该结果从细胞计数和细胞因子两个方面证实了吉西他滨对缓解Th17/CD4+CD25+Treg漂移有积极作用。

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤间质中数量最多的炎症细胞群，大约占炎症细胞总数的30%～50%[13]。研究指出[14]，肿瘤相关巨噬细胞能通过加快淋巴结转移与血行转移促进宫颈癌细胞的散播和扩展。也有研究指出[15]，肿瘤相关巨噬细胞能够分为极化为M1型和M2型，参与肿瘤免疫炎症的调控，类似于Th1细胞和Th2细胞。鉴定肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞多采用免疫组织化学实验测定CD68的表达水平，虽然CD68也表达于脂肪细胞、成纤维细胞等其他细胞，但因为巨噬细胞缺乏特异性的谱系标志，目前尚无更好的方案。本研究采用传统方案，以CD68表达水平衡量肿瘤相关巨噬细胞，结果显示两组病灶组织的肿瘤相关巨噬细胞表达量均高于健康组织，且观察组病灶组织表达量高于对照1组病灶组织。既往也有学者[16]指出，肿瘤组织与周边正常组织之间的肿瘤相关巨噬细胞表达存在明显的“梯度差”，与本研究结果一致。肿瘤相关巨噬细胞多来源于外周循环血中的单核细胞，受肿瘤微环境的诱导，向病灶处迁移并分化为巨噬细胞，从而为病灶增殖做准备。本研究结果一方面证实了“梯度差”的存在事实，另一方面也说明吉西他滨对肿瘤相关巨噬细胞具有明显的抑制作用。

综上所述，吉西他滨能够抑制宫颈癌患者Th17/CD4+CD25+Treg漂移和肿瘤相关巨噬细胞活性，可能是其发挥抗癌作用的重要机制之一。本研究的主要局限性在于未行靶向干预实验，明确Th17/CD4+CD25+Treg和肿瘤相关巨噬细胞之间是否存在相关性，因此，本研究仅能明确吉西他滨能作用于两者，但其确切机制尚需更加严谨的实验深入探讨。