张洪瑞，朱其松，李广贤，周学标，袁守江

(山东省水稻研究所,山东 济南 250100)

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以稻米为主食，同时它也是我国最主要的栽培作物之一。近半个世纪以来，三系和两系杂交水稻的选育成功，使得我国的水稻单产取得了大的飞跃。然而杂交水稻在发展初期也受诸多因素困扰，其中尤为突出的是制种产量低、异交结实差，从而导致制种成本居高不下，限制了杂交水稻尤其是杂交粳稻的大面积推广[1]。柱头外露率是野生稻和栽培稻之间一个重要的分类性状，也是一个重要的农艺性状，柱头外露率的高低是反映三系和两系不育系杂交结实性的一个重要农艺指标。对控制柱头外露率的基因进行定位和克隆，不仅可从功能基因方面揭示水稻起源演化的分子机理，而且在生产上对水稻育种有重大应用意义[2]。改良水稻雄性不育系的柱头外露率，提高杂交水稻制种产量，降低种子生产成本，是当前国内外水稻育种专家发展杂交水稻生产亟待解决的关键问题之一[3]。柱头外露率在野生稻中表现较高，而在栽培稻中表现相对较低。在栽培稻中，柱头外露率在不同品种间变异也很大[4]，尤其在水稻籼粳亚种间差异显著，一般而言，籼稻品种的柱头外露率普遍高于粳稻品种[5]。

有关柱头外露率的遗传特性，多数研究表明柱头外露相关性状是由多基因控制的数量性状[3,6-9]。目前为止，李文宏等[2]利用窄叶青8号和京系17构建DH群体，检测到2个控制水稻柱头外露率的QTL；沈圣泉等[4]利用协青早B和密阳46构建RIL群体，检测到1个QTL；李晨等[10]利用栽培稻和普通野生稻构建BC1群体，检测到2个QTL；Uga等[6]利用Peikuh和W1944构建RIL-F8群体，检测到2个控制柱头外露率的QTL。

本研究利用由贵2136S/日本晴配制的F2群体构建了一张关于水稻柱头外露的遗传连锁图谱，利用覆盖全基因组的InDel和SSR两种分子标记对柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率、穗粒数和柱头颜色进行QTL分析，尽可能发掘有利用价值的控制花器性状的等位基因，为杂交水稻花器性状的遗传改良提供辅助选择标记，应用于遗传育种实践，从而培育出优质、高产水稻新品种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以柱头外露率高、柱头颜色为紫色的籼稻两系不育系贵2136S与柱头外露率低、柱头颜色为白色的粳稻品种日本晴(Nipponbare)作为亲本，以300株2136S/日本晴的F2单株为QTL初步定位群体。

1.2 DNA提取及PCR分析

试验采用CTAB法提取F2代各单株叶片总DNA[11]，利用筛选出的多态性引物进行PCR扩增，扩增产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳后采用AgNO3显色。

1.3 性状调查

2009年冬，在海南南繁基地，调查亲本贵2136S和日本晴以及F2代柱头外露的相关性状。分别取两亲本各20个单株、 F2群体300个单株进行相关性状表型考查，以平均值表示。每株选取颖花完全盛开后的3～5穗主穗，计数柱头单边外露数、柱头双边外露数、柱头不露的颖花数和柱头颜色，并统计各柱头外露性状的比率，柱头单边外露率(percentage of single exserted stigma, PSES)、柱头双边外露率(percentage of dual exserted stigma, PDES)、柱头总外露率(percentage of total exserted stigma, PES)、穗粒数(spikelets per panicle, SPP)和柱头颜色(stigma color, SC)。

1.4 构建遗传图谱及QTL分析

由已公布的水稻基因组序列信息[12,13]，利用Primer Premier 5.0软件，设计片段大小为150～250 bp的InDel分子标记,另基于公开发表的水稻SSR图谱(http://www.gramene.org/)序列，针对亲本贵2136S与日本晴，筛选具有多态性的分子标记。采用复合区间作图法(CIM)，利用QTL IciMapping 3.1软件(http://www.isbreeding.net/) 对F2分离群体进行全基因组扫描，LOD值2.5作为阈值，建立与目标基因连锁的标记遗传图，计算每个QTL对应性状的贡献率，QTL的命名原则遵循文献[14]。

2 结果与分析

2.1 亲本及群体的性状分析

由表1可见，母本贵2136S的柱头单边外露率(PSES)、柱头双边外露率(PDES)、柱头总外露率(PES)和穗粒数(SPP)分别为48.2%、35.1%、83.3%和180；父本日本晴的柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率和穗粒数分别为3.1%、0.2%、3.3%和104；两亲本各柱头外露性状存在明显差异。由图1、图2、 图3所示，F2群体柱头单边外露率与柱头双边外露率表现出连续变异，其偏态系数和峰度系数均小于1，呈正态分布；平均值分别为32.9%、16.1%，其变异范围(即最大值和最小值)都超出了亲本的表型值，出现了超亲分离现象，表现出数量性状的特征；适合用QTL相关软件进行数量性状分析。柱头总外露率呈双峰连续分布特征，说明该性状可能是由一个主效基因与多个微效基因共同控制的性状。

表1 双亲及F2群体的柱头外露率表型

图1 贵2136S/日本晴F2群体柱头单边外露率频率分布

图2 贵2136S/日本晴F2群体柱头双边外露率频率分布

图3 贵2136S/日本晴F2群体柱头总外露率频率分布

2.2 各性状间相关分析

对亲本贵2136S、日本晴以及贵2136S/日本晴的F2群体单株的柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率和穗粒数性状进行相关分析，结果见表2。柱头总外露率与柱头单边外露率和柱头双边外露率两两之间均具有极显著正相关关系，相关系数分别为0.836、0.863和0.444，由此推测控制柱头总外露率和柱头单边外露率或柱头双边外露率的基因可能是相同基因或同源基因；柱头各外露性状和穗粒数没有明显的相关性，推测柱头外露性状与穗粒数由不同的基因控制。

表2 双亲及F2群体中各性状的相关分析(Pearson函数)

注：**表示0.01显著水平。

2.3 遗传连锁图谱的构建

共筛选出153对多态标记，包括7对SSR标记和146对InDel标记，对F2代进行PCR扩增，采用QTL IciMapping 3.1软件，构建了关于柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率、穗粒数和柱头颜色(SC)的遗传连锁图。图谱总长1 921.03 cM，标记间平均距离为12.56 cM，如图4。

2.4 有关柱头外露率QTL定位

关于柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率、穗粒数和柱头颜色五个性状共检测出38个QTL，分布于12条染色体上(图4、图5、图6和表3)。其中6个LOD值与贡献率较高的主效QTL的增效基因均来自贵2136S等位基因的相关位点。

柱头单边外露率：检测到1个影响柱头单边外露率的主效QTL，位于3号染色体RM5488～I-3-21之间，命名为qPSES-3。其LOD值和贡献率分别为13.122和21.108%。

柱头双边外露率：检测到1个影响柱头双边外露率的主效QTL，位于3号染色体105 cM处，I-3-18～RM5488之间，命名为qPDES-3，其中LOD值和贡献率分别为19.454和29.780%。

图4 贵2136S/日本晴F2群体的遗传连锁图谱

图5 有关柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率、穗粒数和柱头颜色QTL的似然值

图6 有关柱头单边外露率、柱头双边外露率、柱头总外露率、穗粒数和柱头颜色QTL的贡献率

表3水稻贵2136S/日本晴F2群体柱头外露率的QTL定位

柱头总外露率：检测到1个影响柱头总外露率的QTL，位于3号染色体RM5488～I-3-21之间，命名为qPES-3，LOD值和贡献率分别为21.579和25.659%。

穗粒数：检测到1个影响穗粒数的主效QTL，命名为qSPP-6，位于6号染色体的I-6-4～I-6-5区间，LOD值和贡献率分别为14.991和22.151%。

柱头颜色：检测到2个影响柱头颜色的主效QTL，分别命名qSC-1、qSC-6。其中qSC-1位于1号染色体I-1-10～I-1-12之间，LOD值和贡献率分别为27.662和47.209%，该位点的增效基因来自贵2136S等位基因位点。qSC-6位于6号染色体I-6-2～I-6-3之间，LOD值和贡献率分别为27.453和40.982%。

3 讨论与结论

水稻是典型的自花授粉作物，花器构造适于自交而不利于异交，其柱头外露率的高低决定了母本受粉能力，直接影响了水稻不育系繁殖以及杂交稻制种产量；柱头外露率和柱头相关性状是建立水稻异交栽培理论和技术的重要依据，也是选育不育系的重要目标性状。

本研究选用的母本贵2136S为两系法杂交水稻两用核不育系的籼型水稻，从分子水平研究其性状，可为杂交制种提供理论依据，具有重大意义。本研究共统计了300株F2群体各性状的表型，为了增加基因型分析的有效性[15]选择了237株双尾极端表型个体，分析了各标记与所有QTL的连锁关系。本研究通过贵2136S/日本晴构建的F2群体柱头外露性状的QTL检测与分析，发现柱头外露率是由多基因控制的数量性状，并将控制柱头外露率的QTL初步定位在第3染色体，同时发现控制柱头单边外露率和柱头总外露率的QTL完全一致，这与前人的报道一致[2, 16-18]。李文宏等[2]利用DH群体检测到控制水稻柱头外露率的QTL位于第2、3染色体，同时定位控制穗粒数的QTL于第6、8染色体上，与柱头外露率之间没有连锁关系。Miyata等[16]利用Koshihikari和98SQ1496配制的F2群体，检测到控制柱头外露的QTL定位在第3染色体。Yu等[17]利用RIL群体，检测到控制柱头外露的QTL定位在第3、5、12号染色体。冯玲玲等[18]利用50S和连B构建F2群体，检测柱头外露率在第3、9、12染色体，其贡献率分别为8.7%、4.9%和5.3%。推测该染色体标记区段的确可能存在影响柱头外露率的QTL，而且目标基因可能具一因多效性，可开发出与目标QTL位点两侧都紧密连锁的分子标记，通过构建大量精细定位群体，更精细定位并进一步克隆该QTL位点，分析其功能蛋白的作用模式。

由于柱头外露率遗传背景多样，受多基因控制，并受环境影响[4]，此外还受群体类型、大小、阈值、目标性状的遗传力限制[19]以及亲本遗传背景的影响[20]等，诸多因素导致各研究定位结果有所差异。初步统计，有关柱头外露率的QTL已检测出40多个，分布在不同位置。

本研究检测到穗粒数相关QTL定位在第6染色体I-6-4～I-6-5之间，与柱头外露率之间无显著连锁关系。李文宏等[2]利用窄叶青8号/京系17配制的DH群体，也将控制穗粒数的QTL定位在第6染色体，不过具体位置不一致，应利用更大群体继续精确定位研究。关于柱头颜色的定位，本研究统计了300株F2群体柱头颜色，发现分离比为2∶1，不符合孟德尔质量性状遗传规律，遂用QTL软件分析，紫色记为1，无色记为0。在前人的研究中，尚未有柱头颜色定位的报道。本研究检测到2个柱头颜色QTL，分别位于第1染色体和第6染色体I-1-10～I-1-12之间和I-6-2～I-6-3之间，贡献率分别为47.209%和40.982%，总贡献率为88.191%，为主效QTL，增效基因来自贵2136S。克隆与柱头颜色相关的QTL，研究并分析其表达蛋白功能作用方式，可将其应用到大田育种，便于识别，减轻杂交育种工作量，以促进杂交粳稻的发展。

在水稻的遗传学研究中，应扩大研究材料，利用不同群体进行研究，全面准确了解水稻各性状之间的相关性，进一步明确水稻各种性状的遗传控制机理。