孔令宇, 席 錾, 马文婷, 刘根生

(1 新乡医学院第一附属医院, 河南 新乡 453100; 2 新乡医学院三全学院, 河南 新乡 453100)

脓毒症是重症患者死亡的主要原因之一，脓毒症和脓毒性休克导致的病死率分别高达50%和68%[1]。脓毒症初期，在细菌内毒素等物质的诱导下，机体分泌大量炎症介质，导致脓毒症患者体内存在强烈的免疫炎症应答。随着疾病的持续进展，机体出现免疫平衡紊乱和特异性免疫功能失调，使机体难以清除感染[2]，故脓毒症患者存在着不同程度的细胞免疫功能紊乱或损害。目前国内外对脓毒症免疫障碍机制的研究越来越关注，尤其是经临床治疗后，机体的免疫状态与脓毒症的发生、发展以及预后有着密切关联。近年来，连续性肾脏替代治疗(continuous renal replacement therapy, CRRT)在非肾脏病领域的优势得以凸显，传统抗感染等集束化治疗联合CRRT能降低脓毒症患者的炎症反应，并调节机体的免疫应答[3]。CRRT主要通过连续清除血液循环中的毒素、中小分子物质、致病介质来维持人体内环境稳定，具有清除率高、血流动力学稳定等优点。既往研究[4]已发现CD8+T细胞参与脓毒症疾病的主要过程，而CRRT对脓毒症患者总T细胞数量、CD4+/CD8+T细胞比例等无明显影响，但对脓毒症患者CD8+T淋巴细胞的免疫功能影响尚不明确[5]。故本研究通过观察脓毒症患者CD8+T淋巴细胞的免疫功能变化，探究CRRT对脓毒症患者CD8+T细胞免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2015年10月—2016年8月入住某院急诊科的脓毒症住院患者的病历资料。脓毒症的诊断依据2016年颁布的Sepsis 3.0脓毒症诊断标准[6]；排除标准：既往存在慢性肾衰竭，需规律行透析的患者；接受过心、肾或肝移植术的患者；合并自身免疫性疾病的患者；合并严重基础疾病(如：恶性肿瘤终末期)的患者。本研究已取得患者及家属的知情同意，并签署知情同意书，研究方案经该院伦理委员会审批通过，符合伦理学标准。

1.2 仪器与试剂 淋巴细胞分离液、LPS试剂均为美国Sigma公司产品。人CD8+T细胞分离液试剂盒为德国美天旎公司产品。干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)试剂盒、抗CD3-FITC和抗CD8-APC均为美国BD公司产品。Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品。反转录PCR试剂盒PrimeScript RT reagent kit、实时定量PCR试剂盒STBR Premix Ex Taq均为TaKaRa公司产品。IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒为武汉华美公司产品。Trucount绝对计数管、CD3/CD4/CD8荧光标记单克隆抗体、FACS Calibur流式细胞仪均为美国BD公司产品。磁力分离架为德国美天旎公司产品。ELISPOT读板仪为德国AID公司产品。实时定量PCR分析仪为美国ABI公司产品。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 根据《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》[7]的推荐意见，所有脓毒症患者均给予抗感染、针对原发病的对症支持治疗、机械通气、预防深静脉血栓等集束化治疗，同时所有脓毒症患者均在发病7 d内行单次床旁CRRT，治疗模式均为连续性静脉-静脉血液滤过(CVVHF)，血流量为180 mL/min，置换液量为4 L/h，持续透析24 h。滤器包括聚砜膜和AV69膜，血管通路均为股静脉置管，置换液为碳酸氢盐置换液，抗凝方式包括枸橼酸和低分子肝素抗凝。

1.3.2 研究方法

1.3.2.1 外周血单个核细胞(PBMCs)的分离 分别于CRRT前后采集脓毒血症患者EDTA抗凝外周血10 mL，使用密度梯度离心法分离PBMCs(107个/mL)，于37℃、5% CO2条件下，用含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基进行培养。

1.3.2.2 CD8+T淋巴细胞的纯化与计数 应用磁珠分离法纯化CD8+T淋巴细胞：取107个PBMCs，离心后应用40 μL缓冲液重悬细胞，加入10 μL生物素标记的抗体鸡尾酒，混匀后于4℃静置孵育5 min，加入30 μL缓冲液和20 μL CD8+T细胞免疫磁珠鸡尾酒，混匀后于4℃静置孵育10 min，将细胞悬液加入分离柱中，收集流出液，其中含有未被标记的富集的CD8+T淋巴细胞。应用流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞计数：向TruCOUNT绝对计数管中准确加入20 μL CD3/CD4/CD8荧光标记单克隆抗体和50 μL抗凝全血，4℃避光孵育15 min后加入450 μL FACS红细胞裂解液，室温避光孵育45 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测，MultiSET软件分析CD8+T淋巴细胞绝对计数。

1.3.2.3 脂多糖(LPS)刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞数 向包被抗IFN-γ单克隆抗体的96孔PVDF膜板中加入100 μL PBMCs(106个/mL)和LPS(10 μg/L)，阳性对照组加入PBMCs和植物血凝素，阴性对照仅加入PBMCs，于37℃、5%CO2条件下孵育12 h，洗涤后每孔加入100 μL生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体，室温孵育1 h，洗涤后每孔加入100 μL碱性磷酸酶标记的链球菌亲和素，室温避光孵育45 min，洗涤后加入显色剂反应15～20 min。终止反应后使用ELISPOT读板仪计数，以斑点形成细胞数(spot forming cells, SFC)/106PBMCs为单位计数产生IFN-γ的CD8+T淋巴细胞。

1.3.2.4 检测CD8+T细胞中细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性死亡受体1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(TIM-3)、CD28、IFN-γ、TNF-α的表达 应用实时定量PCR检测CD8+T细胞CTLA-4、PD-1 、含TIM-3和CD28的表达：取106个分离的CD8+T细胞，加入LPS刺激培养6 h，收集细胞和培养上清进行后续实验。将收集的细胞于2 h内使用Trizol试剂提取总RNA。建立反转录反应体系，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。建立SYBR实时定量PCR反应体系，反应条件：预变性(95℃，30 s)；PCR反应(95℃，5 s；60℃，30 s)。应用2-ΔΔCT法对目的片段的相对表达水平进行分析。引物序列如表1所示。收集培养上清，应用ELISA试剂盒检测培养上清中IFN-γ、TNF-α的表达水平。

表1 实时定量PCR引物序列

2 结果

2.1 一般资料 2015年10月—2016年8月共有37例脓毒症住院患者符合入选条件，其中男性23例，女性14例，平均年龄为(49.83±11.52)岁。引发脓毒症病因有肺部感染(22例)、腹腔感染(10例)、急性重症胰腺炎(2例)、多发伤(2例)、植入物感染(1例)。所有患者血培养均为革兰阴性(G-)菌，其中感染的细菌种类为肺炎克雷伯菌(22株)、鲍曼不动杆菌(11株)、阴沟肠杆菌(3株)。

2.2 CRRT前后患者一般情况比较 脓毒症患者接受CRRT后平均动脉压、血红蛋白、血小板计数、清蛋白、血钾、血钠、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分较治疗前均无明显变化(均P>0.05)；体温、心率、白细胞计数、尿素氮、血肌酐水平均较治疗前下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.3 CRRT前后总CD8+T细胞数量和分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量 脓毒症患者总CD8+T细胞数量在CRRT前后无明显变化(P>0.05)；CRRT后分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 CRRT前后CTLA-4、PD-1、TIM-3、CD28、IFN-γ、TNF-α表达情况 脓毒症患者经CRRT后CD8+T细胞(受LPS刺激后)产生抑制性分子CTLA-4、PD-1、TIM-3 mRNA的水平均较治疗前降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；而产生共刺激性分子CD28 mRNA的水平较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CRRT后CD8+T细胞分泌IFN-γ的水平较治疗前升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但分泌TNF-α的水平治疗前后无明显变化(P>0.05)。见表4。

表2 CRRT前后脓毒症患者一般情况比较

表3CRRT前后总CD8+T细胞和分泌IFN-γ的CD8+T细胞数量比较

Table3 Comparison of total CD8+T cell count and IFN-γ-secreting CD8+T cell count before and after CRRT

组别总CD8+T细胞(个/μL)分泌IFN-γ的CD8+T细胞(SFC/106 PBMCs)治疗前450.50±62.9840.25±9.00治疗后426.80±84.5691.25±21.58t0.4343.584P0.6940.037

3 讨论

随着对CRRT认识的深入和技术的完善，CRRT在脓毒症治疗中的作用已得到了广泛认可。CRRT不仅能有效清除脓毒症患者中小分子溶质、与脓毒症相关的炎症因子、纠正电解质和酸碱平衡紊乱，而且还可在稳定血流动力学的基础上改善免疫应答失衡、保护重要脏器功能、维持内环境稳态[8-9]。

表4 CRRT前后CD8+T细胞中抑制性分子、CD28 mRNA及分泌细胞因子变化

因此，无论脓毒症患者是否存在急性肾功能-损伤，均可在集束化治疗的基础上加用CRRT，最终降低脓毒症患者病死率。本研究发现脓毒症患者经CRRT后，白细胞计数、尿素氮、血肌酐较治疗前改善，提示CRRT对小分子溶质有良好的清除作用；同时患者体温、心率较治疗前下降，考虑不但与炎症介质清除有关，还可能与治疗时置换液的温度导致物理降温有关。患者CRRT前后平均动脉压、血红蛋白、清蛋白、血钾、血钠均未见明显变化，提示CRRT具有良好的血流动力学稳定性，且对患者的营养状态影响不大，进一步证实了CRRT对脓毒症患者的安全性和有效性[10]。

既往研究[11]表明，脓毒症患者通常对由CD8+T细胞控制的细胞内病原体的“继发性”感染高度敏感。在外源性致敏源的刺激下，CD8+T细胞通过特异性识别由MHC I类分子提呈的内源性抗原肽，进而杀伤病原体感染的细胞或肿瘤细胞，在感染和肿瘤免疫中发挥重要作用；CD8+T细胞发挥细胞毒性作用可通过分泌细胞因子、调控靶细胞坏死和凋亡等机制实现，同时多种因素可调控CD8+T细胞免疫功能[12]。Burnner等[13]研究已证实，在严重脓毒症发展过程中出现了倾向于Th2型的免疫反应，即T细胞免疫有向Th2方向漂移趋势，明显损害了机体的细胞免疫功能。由于本研究中CD8+T细胞免疫功能需要对其进行刺激培养，对脓毒症患者而言，G-菌感染占大多数，同时LPS作为G-菌细胞壁最外层的类脂多糖类物质，虽抗原性较弱，但毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、休克等症状；因此，在本研究中选择了G-菌感染所致的脓毒症患者作为研究对象，使用LPS作为刺激源对脓毒症患者CD8+T细胞免疫功能进行分析。本研究发现，脓毒症患者在CRRT前后总CD8+T细胞的数量无明显变化，与既往研究[5]结果一致。但在LPS刺激下，无论总PBMCs中分泌IFN-γ的细胞数量还是分离纯化的CD8+T细胞直接分泌IFN-γ的水平，在CRRT后均明显升高，提示CRRT可提升CD8+T细胞分泌细胞因子的能力。IFN-γ是杀伤细胞内寄生病原体的主要细胞毒性因子，进一步提示CRRT可提升CD8+T细胞的细胞杀伤功能，进而有效控制脓毒症的病情进展。

然而，CRRT提升CD8+T细胞免疫功能的机制尚不清楚，抑制性免疫分子可调控CD8+T细胞免疫功能。在脓毒症患者中，抑制性免疫分子PD-1、CTLA-4和TIM-3在CD8+T细胞中的表达升高，提示上述抑制性因子可促进脓毒症患者CD8+T细胞衰竭，抑制免疫应答，导致机体不能清除病原体而使疾病进展[14]。同时，PD-1/PD-L1和TIM-3信号通路均可作为预测脓毒症/脓毒性休克治疗效果和预后的指标[15-17]。本研究发现，脓毒症患者经CRRT后，即使经LPS刺激，分离纯化的CD8+T细胞中PD-1、CTLA-4和TIM-3 的表达水平明显降低，而共刺激分子CD28水平显著升高，提示CRRT可通过降低抑制性免疫分子的表达促进CD8+T细胞免疫功能，但这种作用是直接性还是间接性还有待进一步研究，同时在患者免疫系统中体液免疫和细胞免疫之间的相互作用，未作为研究的关注点。本次研究未包含革兰阳性菌感染的脓毒血症患者，由于不同种类的细菌代谢产物等有所不同，可能对CD8+T细胞免疫功能的激活途径不同，希望后期实验对这个因素进行排除干扰。

总之，CRRT在脓毒症患者的治疗中具有良好的安全性和有效性，不但能改善脓毒症患者的生命体征和肾功能，还可增强脓毒症患者外周血CD8+T细胞免疫功能，促进机体清除病原体感染，对降低脓毒症患者病死率和改善预后均具有重要意义。