赵 彬， 武 峰， 白莹莹， 方 敏， 王 璐

(1. 山西医科大学 口腔医学院，山西 太原 030001；2. 山西医科大学 汾阳学院，山西 汾阳 032200)

1 前言

牙齿缺损的修复是再生医学领域的研究热点之一。目前，种植修复牙列缺损或缺失是口腔修复领域的主流技术。然而，由于患者长期缺牙或因外伤、肿瘤等导致的种植位点骨缺损或骨量不足是种植修复技术面临的一大难题。针对种植位点骨量的严重缺损和不足，需要在种植前期或同期对牙槽骨缺损进行修复，以提高种植的成活率和修复效果。

引导性骨再生技术(GBR)是解决三维骨量不足的有效方法，其原理是在使用骨替代材料充填骨缺损区域的同时，将具有生物安全性的屏障膜植入，一方面阻隔成纤维细胞长入骨创，同时提供空间、有效的保证骨细胞优先充满膜下方的骨缺损间隙，促进新骨生成、重塑和改建[1]。屏障膜是引导性骨再生技术中的关键问题，其性能的优劣直接决定着骨组织再生的效果。目前临床最常用的屏障膜为胶原膜，但存在降解速率较快并且力学性能不足的缺陷[2]，直接影响骨组织再生及修复的效果。因此，探索和改进能够提供良好机械强度和稳定性，与骨缺损修复时间相适应的屏障膜，可以使膜引导骨再生技术的临床应用更加广泛。

丝素蛋白(SF)是一种源于蚕丝、性能优良的生物材料，可作为生物医用材料用于皮肤、骨、神经等组织的修复及再生[3-5]。蚕丝经提纯后可被制成各种形态的生物材料，包括膜、多孔支架、凝胶以及无纺网等，其中SF膜就被广泛应用于引导性骨再生的研究。Song等[6]将SF膜覆盖于新西兰白兔的头骨缺损处，结果显示，SF膜的使用能够显著的促进新骨的生成。Kim等[7]将SF膜与Bio-Gide胶原膜进行对比，术后8周的结果显示SF膜组和胶原膜组新骨生成量较为接近，考虑到胶原的免疫原性和昂贵的价格，他们认为SF膜是除胶原膜以外的另一选择。Ha等[8]对比了SF膜、胶原膜以及聚四氟乙烯(PTFE)膜对骨组织再生的效果。实验结果显示，SF膜表现出最佳的骨诱导性。

石墨烯类材料是一种新兴的纳米碳质材料，具有独特的二维结构、优良的力学、热学[9]以及生物学性能，现已被广泛的应用于药物载体、组织工程、细胞成像等生物医用领域的研究[10-12]。国内外研究表明，氧化石墨烯(GO)具有丰富的含氧官能团，可以均匀的分散在高分子溶液中制备成不同种类的生物材料，GO的引入会明显改善复合材料的理化性能甚至生物学性能[13-15]。体外细胞培养结果也显示，低浓度的石墨烯在细胞水平上是一种安全的新型材料。值得注意的是，经高分子修饰后的石墨烯类材料在诱导HAp 矿化以及骨修复领域中的相关研究揭示了其具有一定的骨诱导能力[16-18]。

辛伐他汀(SIM)是一种临床常用的降脂药物，20世纪末Mundy等[19]发现SIM能促进BMP-2的表达，促进新骨生成。Maeda等[20]发现SIM作用于MC3T3-E1细胞可上调VEGF基因的表达，能够促进成骨细胞增殖与分化。Liu等[21]证实在Wistar大鼠拔牙窝内局部应用SIM可显著上调TGF-β1、VEGF、BMP-2 mRNA基因表达水平。

理想的屏障膜应具备足够的机械性能、与骨组织新生速率相匹配的降解速率、良好的生物学性能并能诱导骨再生。在此之前，本课题组从材料的成分及结构出发，设计并制备了GO/SF多孔支架[22]，利用GO的引入，实现了对材料理化性能、释药性能、生物降解性能的改进。GO改进后的复合材料，其各方面性能都得到了提升，如果将其制备成具有双层结构的膜材料，可能会在引导性骨再生领域取得一定成果。因此，在前期研究基础上，将GO/SF基生物材料以屏障膜的形式用于引导性骨再生领域，研究屏障膜的体外、体内生物学性能，探讨其在引导性骨再生领域的可应用性及发展前景。

2 实验部分

2.1 主要试剂

氧化石墨烯，南京先丰纳米材料科技有限公司；家蚕生丝，江苏省鼎盛丝绸有限公司；辛伐他汀，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；MC3T3-E1细胞，通派(上海)生物科技有限公司；SD大鼠，山西医科大学实验动物中心；DMEM细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，Gibco，美国；CM-DiI荧光蛋白，Invitrogen，美国；Cell Counting Kit-8，南京建成生物制剂有限公司；茜素红 S、钙黄绿素，Sigma，美国；其他试剂和溶剂均为分析纯；实验用水为去离子水和蒸馏水。

2.2 溶液的制备

精确称取20 mg GO，用功率为300 W的超声波清洗器将其分散于10 mL去离子水中，配制成浓度为2 mg/mL的GO水溶液。取50 g家蚕生丝，在煮沸的、浓度为0.05%的Na2CO3水溶液中重复处理3次，每次30 min，去离子水洗涤后于60 ℃ 烘干得到精炼蚕丝。72 ℃下将脱胶丝溶于三元溶液(氯化钙∶乙醇∶水=1∶8∶2 摩尔比例)中1 h，去离子水透析4天，得到浓度为3.5 wt%的再生SF蛋白水溶液。

2.3 屏障膜的制备

SF膜：用去离子水将浓度为3.5 wt%的SF溶液稀释至2 wt%，然后加入占SF质量30%的甘油，充分搅拌，真空脱泡。

GO/SF膜：将浓度为3.5 wt%的SF溶液与GO溶液混合，其中GO的质量占SF质量的0.5 wt%，用去离子水将溶液的总浓度稀释至2 wt%，然后加入占SF质量30%的甘油，充分搅拌，真空脱泡。

GO/SF/SIM膜：精确称取一定质量的SIM，超声分散于去离子水中，配制成10 mg/mL的分散液。将配制好的GO/SF混合溶液与SIM分散液共混，其中SIM添加量分别占SF质量的2.5 wt%和5 wt%，充分搅拌，真空脱泡。

将以上配置好的溶液倒入直径为9 cm的表面皿中，于-20 ℃冷冻2 h后，真空减压干燥约36 h得到SF膜、GO/SF膜以及GO/SF/SIM膜。

2.4 屏障膜的形貌、聚集态结构及释药性能测试

将GO/SF屏障膜抽真空后喷金，用JSM-7001F 型扫描电子显微镜(SEM)观察其表面和横截面。将冻干后的膜剪碎成粉末状，使用日本Rigaku公司生产的Miniflex II衍射仪，CuKα射线，记录样品在2θ=5°～40°之间的衍射强度曲线。将载有SIM的屏障膜制成3 cm×3 cm的小方块，置于50 mL PBS中，在37 ℃的恒温振荡水槽中进行释放，每组重复3次。在15天的释放周期内，每隔一天取出3 mL溶液，同时补充3 mL新鲜的PBS，直至释药实验完成。用紫外分光光度计(日立 UV-2800)测定取自不同时间点的溶液在238.5 nm处的吸光度，得到不同材料的体外释药曲线。

2.5 屏障膜的体外细胞相容性

将每组屏障膜裁剪成直径约为10 mm的圆形，Co60辐照灭菌，无菌PBS冲洗3遍备用。选用第三代MC3T3-E1细胞，采用荧光染料CM-DiI进行标记后，以1×105/孔接种于24孔板中，每隔两天换液，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。于接种后7天在共聚焦显微镜下观察细胞与材料的结合情况以及细胞的增殖状态。细胞增殖与活力通过CCK-8测定，分别在细胞培养的1、3、5、7天，将24孔板中培养基吸出，材料-细胞复合物经PBS漂洗3遍之后，每孔加入50 μL CCK-8试剂，然后加入450 μL DMEM并摇匀，将培养板置于培养箱继续培养3 h后，每孔吸出100 μL至96孔板，用酶标仪检测450 nm下的吸光度，以6个平行样的结果求平均值并绘制细胞生长曲线。

2.6 屏障膜用于引导性骨再生的体内实验

2.6.1 实验动物和材料

清洁级8周龄雄性SD大鼠24只，体重为180～200 g(山西医科大学实验动物中心提供)。屏障膜材料：GO/SF/SIM膜、GO/SF膜、SF/SIM膜、SF膜。

2.6.2 动物模型的建立及分组

大鼠称重，巴比妥麻醉，俯卧位将其固定于手术台上。头部备皮，碘伏消毒。沿头盖骨正中线纵向切开皮肤约3 cm，钝性分离皮下组织，剥离骨膜，暴露顶骨。用低速钻在生理盐水的降温下制备骨缺损模型，造成两个直径为5 mm的骨缺损区域(图1a、b)。24只大鼠随机分为4组，每组6只：实验A组植入GO/SF/SIM膜、实验B组植入GO/SF膜、实验C组植入SF/SIM膜、对照D组植入SF膜。植入后缝合皮下组织及皮肤创口，分笼饲养。

图 1 植入屏障膜的表观形貌和动物模型的建立：(a,b)大鼠颅骨缺损的制备,(c,d)屏障膜植入

2.6.3 序列荧光标记

为检测术后不同时期新骨生成情况，采用序列荧光标记新生骨组织[23,24]。乙醚轻度麻醉下，于术后6周时对各组大鼠皮下注射茜素红S，9周时皮下注射钙黄绿素，注射剂量见表1。为防止荧光标记液流出，注射后实验动物制动1 min左右。茜素红在红外光激发下呈砖红色荧光，钙黄绿素在蓝光激发下呈黄绿色荧光。

表 1 序列荧光标记次序及剂量

2.6.4 取材及样本处理

术后12周处死大鼠，取颅骨标本行肉眼观察，乙醇梯度脱水后，用硬组织切片机(EXAKT，德国)沿标本长轴切割，逐级打磨抛光至50 μm。用激光共聚焦显微镜观察，Image Pro PLUS(Media Cybernetics，美国)图像分析软件测量每组标本缺损边缘向缺损中心方向、向颅外侧方向红色荧光标记带与黄绿色荧光标记带之间的最大垂直连线距离，即为3周时间内该位点钙盐沉积的厚度，记录并进行组间对照统计。脑膜侧方向因荧光标记较少，没有统计意义，不作统计。取所有处死A、B组实验动物的肝、脾、肾标本观察并进行HE染色，对局部应用GO进行生物安全性评价。

2.6.5 统计学方法

图 2 GO/SF屏障膜的扫描电镜照片和X-射线衍射曲线：(a, b)纵截面,(c, d)横截面,(e)X-射线衍射曲线

3 结果与讨论

3.1 GO/SF屏障膜的形貌、聚集态结构与释药性能

GO/SF屏障膜的形貌及其聚集态结构如图2所示。从图2a, b可知，该屏障膜具有典型的双层结构，表面具有一层致密的薄膜，内部则为疏松的多孔结构，这种结构既可以起到必要的屏障作用，又可为组织的修复提供支架支撑，为骨细胞的长入提供合适的微环境。从材料的横截面照片观察(图2c)，屏障膜表现为多孔结构，孔壁上随机分布着一些小孔，孔与孔之间连通性较好，这些特征有利于细胞之间的信号传递，毛细血管的长入，营养物质和氧气的输送以及细胞代谢产物的排泄。此外，将膜的孔壁局部放大至10 000倍，在其内部并未发现有团聚的GO (图2d)，说明GO与SF具有较好的相容性，GO可以较为均匀的分散在SF基体中。图2e所示为GO/SF屏障膜的X-射线衍射曲线。根据前人对家蚕丝素蛋白分子构象的研究，Silk I的主要衍射峰出现在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°附近，Silk II的主要衍射峰出现在9.1°、18.9°和20.7°附近[25,26]。

从图2可以看出，SF膜、GO/SF复合膜均在9.1°、20.7°和24.7°附近出现了明显的衍射峰，主要表现为Silk II结构，内含少量的Silk I结构。甘油的强亲水性可以诱导SF蛋白向更为规整的结构转变，此时的屏障膜具有丝素蛋白最为稳定的的Silk II结构，对材料中药物缓释效果以及生物降解速率都会产生较好的协同效应。图中在10.6°出现明显的特征峰归属于GO[27]，GO/SF膜内部没有出现10.6°附近的特征峰，说明GO在SF蛋白中分散良好。此外，GO/SF膜的XRD曲线上未出现新的衍射峰，说明没有新的结晶形态产生。

图 3 GO/SF/SIM屏障膜的体外释药曲线

GO/SF屏障膜15天内在37 ℃环境下的体外释放曲线如图3所示。各组材料内SIM的释放均分为两个阶段，即突释阶段和缓释阶段。前3天药物突释现象明显，GO/SF/SIM 2.5%组累计释放百分比为(17.88 ± 1.49)%，而GO/SF/SIM 5.0%组和SF/SIM 2.5%组的累计释放率分别达到(34.59 ± 1.52)%、(32.97 ± 1.68)%。产生突释现象的原因在于：存在于屏障膜表面以及与膜结合较弱的SIM分子会率先从材料中脱落。从第4天开始，三组材料的释药曲线逐步趋于平稳，进入缓释阶段，到达第13天时，3组材料的累计释放率分别为(30.56 ± 1.92)%，(43.01 ± 2.42)%，(51.46 ± 1.75)%。值得注意的是，SIM的添加量对材料的释药性能会产生一定影响。在之前的研究中，笔者已经证实，GO可使药物释放速率减缓，释放时间延长，对比GO/SF/SIM 2.5%组与SF/SIM 2.5%组的释药曲线，可以发现确实如此：添加GO后，不管在突释还是缓释阶段，GO/SF/SIM 2.5%组都表现出较低的药物累计释放率，这是GO对SF理化性能以及孔结构的改进导致的。而当进一步提高SIM添加量时，材料在释放初期就表现出较高的释药率，甚至掩盖了GO可以延缓释放这一作用，这可能是由于SIM的添加量过多，在材料中已属于饱和状态，当遇到PBS溶液时，过饱和的SIM分子表现出快速而大量的释放。对比3种材料，笔者发现它们在15天内都具有缓慢释放药物的效果，但GO/SF/SIM 5.0%组和SF组的突释性过大，故其长期释放能力不及GO/SF/SIM 2.5%组。这种持续、缓慢的药物释放特性可能会与生长速率较为缓慢的骨组织具有较为匹配的促进作用。

3.2 GO/SF屏障膜的体外细胞相容性

图4为MC3T3-E1接种后7天的激光共聚焦照片以及7天培养周期内MC3T3-E1细胞在屏障膜上的增长曲线。结果显示，屏障膜在镜下呈黑色，孔结构清晰，经CM-DiI标记的细胞散发出明亮的红色荧光。对比各组材料，可以发现添加GO的屏障膜，其内部的红色荧光亮点较多，荧光强度较强，细胞状态良好，形态呈长梭形，说明在这些样品中的活细胞数量较多，含有适量GO的屏障膜表现出较好的细胞相容性。

将SIM引入材料后，可以发现其内部的红色荧光亮点较空白材料组有所增加，说明从屏障膜中缓慢释放出的SIM可以促进细胞的粘附与生长，细胞增殖较快、活力较好。当多孔膜内部的SIM含量不同时，细胞在材料上的增殖情况并未出现明显差异，均表现出良好的生长态势，无大量细胞死亡，这说明两种药物浓度对细胞都在有效范围之内，具有良好的体外细胞相容性。

从MC3T3-E1细胞在4种屏障膜上的CCK-8检测结果可以看出，在7天的培养过程中，细胞在各组材料上都能生长与增殖，屏障膜上的细胞数量随时间增长而增大，表明材料无细胞毒性。具体而言，在培养初期，细胞在4种屏障膜上生长情况相似；而从3天开始，添加SIM的材料上，细胞数量多于未添加药物的材料，当培养时间延长至7天时，差异更加明显，这说明SIM的添加有利于MC3T3-E1细胞的生长。

图 4 MC3T3-E1细胞在GO/SF/SIM屏障膜上培养7天后的激光共聚焦照片及CCK-8 测试法获得MC3T3-E1细胞在屏障膜上的增长曲线

3.3 GO/SF屏障膜引导大鼠颅骨再生的体内实验

3.3.1 大体观察

术后各时间点取材前，大鼠活动自如，伤口愈合良好，颅骨区域无感染或开裂。取材后可见各组中植入的屏障膜无脱落、红肿、渗出、坏死发生，与周围组织结合良好。

从取出的骨组织标本观察可见，骨缺损边缘与屏障膜材料边界不清，实验A组(GO/SF/SIM)缺损边缘较B(GO/SF)、C(SF/SIM)、D(SF)组更为不规则，缺损范围明显减小，新生组织质地较硬，其骨硬度触感强于B、C、D组；实验B、C组之间大体观察无明显差异，实验A、B、C组的修复效果优于对照D组。4组屏障膜在大鼠体内均发生了不同程度的降解，对比C、D两组材料，添加了GO的A、B两组仅被小部分降解，仍能完整覆盖缺损区，维持较好的屏障作用。

3.3.2 序列荧光标记测定新生骨组织

茜素红 S与钙黄绿素对骨组织中的钙具有较强的标记能力。为了考察新生骨组织在不同时期的生长情况，笔者分别将茜素红 S和钙黄绿素于术后6、9周经腹腔注射至大鼠体内，通过这两种标记物发出的荧光对不同时期新生的骨组织进行动态的监测。

如图5所示，分别测量了各组向缺损中心方向(V向)和向颅外侧方向(H向)红绿荧光标记带之间的最大垂直连线距离。具体而言，向缺损中心方向(V向)，各组材料植入后都有一定的新骨形成。实验A组的骨愈合量与其他三组具有显著性差异，实验B组及C组均与对照D组表现出显著性差异。上述结果表明，在V向的新骨形成过程中，GO或SIM单独使用均可促进骨组织再生，而SIM与GO联合使用时具有交互作用，会对骨缺损的愈合产生明显的协同促进效果。向颅外侧方向(H向)的新骨生成不如V向表现得明显，实验A、B、C三组的骨愈合量与对照D组具有显著性差异，但A、B、C三组之间并无显著性差异。这说明，在H向的新骨形成过程中，单独使用SIM或GO可以略微提高骨愈合量，但GO与SIM之间的交互作用不显著，不能认为同时使用GO与SIM对骨缺损有协同促进作用。产生这种现象的原因可能与不规则颅骨形态有关系，在自然生长状态下，颅骨向缺损中心方向的生长量要远大于向颅内外侧方向的生长量，药物干预可能对改变颅骨固有生长速度的规律并不显著。

图 5 Ⅰ：序列荧光标记标本切片的激光共聚焦照片(12周)：(a) GO/SF/SIM, (b) GO/SF, (c) SF/SIM及(d) SF

3.3.3 局部应用GO在动物体内的生物安全性评价

GO的体内外生物安全性一直是个有争议的问题，本实验取术后12周大鼠实质器官肝、脾、肾进行HE染色，以评价GO在动物体内的生物安全性。图6为植入屏障膜12周时大鼠肝、脾、肾3个重要脏器的HE染色图片，均未见明显异常炎性细胞浸润及异常组织细胞结构，同时未发现有沉积的GO颗粒，证明局部应用低浓度的GO复合材料对大鼠肝、脾、肾脏器短期(3个月)内不会造成损害。

图 6 植入GO/SF/SIM屏障膜12 w时大鼠(a)肝脏,(b)脾脏,(c)肾脏的HE染色照片(×100)

4 结论

以GO和SF为原材料，同时负载SIM，制备了具有双层结构的载药屏障膜，并研究了屏障膜的体外细胞相容性及其作为引导性骨膜的修复效果。结果表明，GO/SF屏障膜具有表面致密、内部疏松的形貌，同时聚集态结构为稳定的Silk II结构，载有SIM的屏障膜在15天内表现出缓释特性。在体外，GO/SF屏障膜可以很好的支持MC3T3-E1细胞的粘附与增殖，GO与SIM的引入都可以促进骨细胞的生长。植入大鼠体内的屏障膜具有促进骨缺损修复的能力，在向缺损中心方向的新骨形成过程中，SIM与GO的联合使用对骨缺损的愈合产生了明显的协同促进作用。此外，在体内局部应用低浓度的GO复合材料是安全的，对大鼠重要脏器短期(3个月)内不会造成损害。GO/SF/SIM复合屏障膜具有稳定的理化性能、良好的体内外生物相容性，并对骨缺损有较好的修复效果，同时制备技术简单，原材料成本较低，有望作为新型屏障膜材料应用于GBR技术中。