马泽刚 黄春花 钟辉云 吴秀丽 周礼仕 刘卓

摘要：建立绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]总皂苷的最佳提取工艺条件，并比较不同产地绞股蓝中的总皂苷含量以及抗氧化活性差异。结果表明，绞股蓝总皂苷最佳提取工艺为60 ℃条件下，60%乙醇回流提取4次，提取时间2 h，料液比为1∶10。不同产地绞股蓝总皂苷含量为江西>广东>云南>陕西>内蒙古>福建>四川>湖北。DPPH自由基清除率结果表明，不同产地绞股蓝抗氧化能力为陕西>湖北>江西>内蒙古>广东>福建>云南>四川。建立的绞股蓝中总皂苷含量提取工艺简便、稳定、可行，不同产地绞股蓝中总皂苷含量和抗氧化活性存在差异，该结果可为今后绞股蓝的开发利用和深入研究提供一定的参考。

关键词：绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]；总皂苷；抗氧化；提取工艺

中图分类号：R284 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）14-0109-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.026 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： To establish optimal extraction technology for the total saponins in Gynostemma pentaphyllum，and prepare the difference of content from different producing areas，and the difference of antioxidant activity. Results showed that the optimal extraction technology was as follow：under 60 ℃，Gynostemma pentaphyllum powder was by reflux extraction in 60% ethanol for 4 times with each time for 2 h. The ratio of sample to extraction solution 1∶10. Total saponin content of Gynostemma pentaphyllum from different producing areas was difference. The highest was Jiangxi，and the lowest was Hubei. The results of DPPH scavenging rate showed that the antioxidant activity of Gynostemma pentaphyllum from different producing areas was difference. The highest was Shaanxi，and the lowest was Sichuan. The results showed that the extraction process was simply，stable and feasible. There was a significant difference in the content of total saponin and antioxidant activity in Gynostemma pentaphyllum from the different areas. It provided certain reference significance for development and further study of the resources in Gynostemma pentaphyllum.

Key words： Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino； total saponin； antioxidant； extraction technology

絞股蓝[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]系葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gynostemma）多年生草质藤本植物[1]。《中药大辞典》名七叶胆，别名小苦药、遍地生根、五叶参，日本名甘茶蔓等[2-4]。该属植物基源复杂、品种繁多，中国有14种和3变种[5]，广泛分布于陕西、四川、湖北、福建、云南等地。绞股蓝中含有皂苷、多糖、黄酮类等化合物及铁、锌、铜、锰、硒等20多种微量元素[6-9]。其中皂苷是绞股蓝的药效成分[10，11]，其药用效果与人参皂苷相似[12]，国内外研究证明绞股蓝皂苷具有明显的抗肿瘤、降血脂、抗疲劳、保肝等作用[13]。本研究以绞股蓝总皂苷得率为指标，采用单因素试验比较不同提取因素对绞股蓝总皂苷提取的影响，并进行正交试验设计优化，进而比较8个不同产地绞股蓝总皂苷的含量，并对其抗氧化活性进行了测定，以期为绞股蓝的开发利用和深入研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8种不同产地的绞股蓝购自于成都市药材市场，经四川卫生康复职业学院副主任药师钟辉云鉴定为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum（Thunb） Makino]；水为去离子水，甲醇、乙醇、正丁醇、高氯酸、香草醛等其他试剂均为分析纯。

7200型可见分光光度计（尤尼科仪器有限公司）；KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 总皂苷测定法

1）对照品溶液的制备。精密称定人参皂苷Rb1 3 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至定容，作为对照品液，备用。

2）供试品溶液的制备。在60 ℃条件下，取烘干的药材粗粉1 g，以10倍药材量60%乙醇提取4次，每次2 h，蒸干后用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。

3）线性关系考察。吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置于10 mL具塞试管中，60 ℃将溶剂挥发干，分别加入5%香草醛冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混匀，密塞，置60 ℃水浴中保温15 min，取出，冷却，加冰醋酸5 mL，混匀，以空白试剂为对照，在550 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程：y=3.412x+0.011 2，R2=0.999 5，线性范围0～50 μg/mL。

4）精密度试验。吸取制备供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，在同一条件下连续测得6次吸光度，RSD为1.02%。

5）稳定性试验。吸取制备供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，分别在0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h测得吸光度，RSD为1.09%。

6）重复性试验。取同一批药材6份，制备供试品溶液，吸取各供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，计算其含量，RSD为1.21%。

1.2.2 单因素对总皂苷提取的影响

1）提取方式對绞股蓝总皂苷提取的影响。①加热提取法。取烘干的江西绞股蓝药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g（下同），在70 ℃条件下，用20 mL乙醇提取1 h，过滤。滤液蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。②冷浸法。在25 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，用10倍于干粉体积的乙醇冷浸24 h，蒸干。用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。③超声提取法。在25 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，用10倍于干粉体积的乙醇浸泡，于超声振荡器中振荡提取60 min，蒸干。用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

2）提取溶剂对绞股蓝总皂苷提取的影响。在70 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，分别置于10倍药材量的水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇加热1.5 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

3）提取温度对绞股蓝总皂苷提取的影响。取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，以10倍药材量的60%乙醇提取1.5 h。提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

4）提取时间对绞股蓝总皂苷提取的影响。在60 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，以10倍药材量的60%乙醇提取，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、3.0 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

5）提取料液比对绞股蓝总皂苷提取的影响。在60 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，分别以5、10、20、30倍药材量的60%乙醇提取2 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

6）提取次数对绞股蓝总皂苷提取的影响。在60 ℃条件下，取烘干的药材粉碎，过60目筛得粗粉，取1 g，以10倍药材量的60%乙醇提取1、2、3、4、5次，每次2 h。蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算得率。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，选取提取温度（A）、提取时间（B）、提取溶剂（C）为考察因素，以总皂苷得率为指标，正交试验因素与水平见表1。

1.2.4 不同产地绞股蓝总皂苷含量测定 在60 ℃条件下，取不同产地烘干的绞股蓝药材粗粉1 g，以10倍药材量的60%乙醇提取4次，每次2 h，蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水层用10 mL正丁醇萃取，正丁醇层蒸干，再加甲醇定容至10 mL。吸取供试品溶液0.6 mL，置于10 mL具塞试管中，测定吸光度，得出总皂苷含量，计算其得率。

1.2.5 不同产地绞股蓝总皂苷抗氧化活性测定 DPPH自由基（1，1-二苯基-2-苦味酰基自由基）清除能力测定方法。将待测物用甲醇溶解，配制成一定浓度后梯度稀释。DPPH自由基浓度0.16 mmol/L。在试管中分别加入2 mL待测液和2 mL的DPPH自由基溶液，充分振摇后置于暗处在室温下反应30 min，然后测定波长517 nm处的吸光度。2 mL待测液加入等体积甲醇作为样品对照，2 mL的DPPH自由基溶液加入等体积甲醇作为空白，测定时用纯甲醇调零，重复3次，取平均值。参照下述公式计算样品的DPPH自由基清除率：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取方法对绞股蓝总皂苷提取的影响 不同提取方法对绞股蓝总皂苷得率的影响见表2，各种提取法总皂苷得率大小顺序为加热提取法>超声提取法>冷浸法。试验目的在于比较提取方法，故未考虑温度的影响，选用加热提取法作为总皂苷的提取方法。

2.1.2 提取溶剂对绞股蓝总皂苷提取的影响 提取溶剂对绞股蓝总皂苷得率的影响见图1，随着提取溶剂乙醇浓度升高，总皂苷得率升高，当乙醇浓度达60%时达到最大，然后下降。可见，提取溶剂乙醇浓度达60%时，对总皂苷提取效果好，总皂苷最佳提取溶剂为60%乙醇。

2.1.3 提取温度对绞股蓝总皂苷提取的影响 提取温度对绞股蓝总皂苷得率的影响见图2，随着提取溶剂温度升高，总皂苷得率升高，当温度达60 ℃时达到最大，然后下降。可见，当温度达60 ℃时，对总皂苷提取效果好，故总皂苷的最佳提取温度为60 ℃。

2.1.4 提取时间对绞股蓝总皂苷提取的影响 提取时间对绞股蓝总皂苷得率的影响见图3。随着提取时间增加，提取效果会更好。但提取时间大于2 h总皂苷得率增加不明显，提取时间为2 h比较合适。

2.1.5 料液比对绞股蓝总皂苷提取的影响 料液比对绞股蓝总皂苷得率的影响见图4，随着料液比增加，总皂苷得率增加。当达到1∶10后趋于稳定见，最佳提取料液比为1∶10。

2.1.6 提取次数对绞股蓝总皂苷提取的影响 提取次数对绞股蓝总皂苷得率的影响见图5，随着提取次数增加，总皂苷得率增多。但4次以后变化不大，最佳提取次数为4次。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表3，以总皂苷得率为考察指标，影响因素的主次顺序提取时间（B）>提取温度（A）>提取溶剂（C），绞股蓝总皂苷提取最佳工艺为A2B2C2。即60 ℃条件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比为1∶10。

2.3 工艺验证结果

按正交试验结果确定的最佳工艺方案，即60 ℃条件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比为1∶10。重复提取烘干的药材粗粉3次，RSD为1.40%，3次差异较小，该工艺稳定、可行。

2.4 不同产地绞股蓝总皂苷含量结果

不同产地绞股蓝总皂苷的含量结果见表4。不同产地绞股蓝总皂苷含量为江西>广东>云南>陕西>内蒙古>福建>四川>湖北。

2.5 不同产地绞股蓝总皂苷抗氧化活性结果

以皂苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算自由基清除率，结果见图6。不同产地绞股蓝氧化能力陕西>湖北>江西>内蒙古>广东>福建>云南>四川，这可能是由于生长环境的不同造成的。

3 结论

通过对绞股蓝总皂苷提取工艺的单因素试验和正交试验分析，确定了绞股蓝总皂苷最佳提取工艺为60 ℃条件下，60%乙醇回流提取4次，提取时间为2 h，料液比为1∶10。不同产地绞股蓝总皂苷含量为江西>广东>云南>陕西>内蒙古>福建>四川>湖北。DPPH自由基清除率结果表明，不同产地绞股蓝抗氧化能力为陕西>湖北>江西>内蒙古>广东>福建>云南>四川。皂苷是绞股蓝发挥其药理活性的主要化学成分，选择总皂苷含量高、抗氧化活性好的绞股蓝品种可直接提高绞股蓝的经济价值。不同产地的绞股蓝总皂苷含量和抗氧化活性存在一定的差异，可能是由于生长环境的不同造成的。

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