李益萍 张言玉 许笑雯 王肖龙

（上海中医药大学附属曙光医院 上海 201203）

目前，我国心血管患者约有 2．9 亿［1］。 脂代谢紊乱在心血管病的发生、发展中起着关键性作用，有效控制血脂可降低心血管事件的发生风险［2-3］。他汀类药物已成为动脉粥样硬化性疾病治疗基石。但在临床实践中，许多患者单用他汀类药物治疗其血脂水平仍不能达标。2012年血脂异常国际研究——中国住院患者他汀类药物治疗率88．9%，接受治疗患者中，38．5%未达低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）目标值［1］。 他汀作用靶点单一，主要是抑制细胞内胆固醇的合成，他汀剂量加倍仅能使LDL-C再降低6%左右，而肝脏损害及横纹肌溶解等不良反应的发生率增加。血脂的调节是一个复杂的过程，涉及多种途径、多种基因的调控，不同的降血脂途径间又有一定的关联性，不能靠单一的途径或靶点来解决。因此，在他汀类药物基础上联合其他降胆固醇机制的药物可能具有协同降低 LDL-C的优势，成为近年临床关注的热点。鉴于目前现代医学中其他降胆固醇机制的药物因其价格昂贵或缺乏临床硬终点的证据，短期内无法大量广泛应用于临床。基础和临床研究表明中药可以影响胆固醇吸收、体内合成、转运、排泄等代谢途径，改善临床心血管事件终点［4］。因此观察中医药对胆固醇其他代谢途径的作用并深入探讨其机制，能够为发展中医药和临床干预提供确切的依据。活血化痰方是本研究组在“痰瘀同治”的治法下，沿用并继承经典原方《太平惠民和剂局方》二陈汤、四物汤合《济生方》二至丸自拟的降脂方，主要由丹参、当归、陈皮、决明子、山楂、黄连等组成。研究发现活血化痰方中黄连、决明子、山楂等组成成分可通过调控胆固醇的代谢途径中的重要酶活性、蛋白或基因的表达来降脂［4］。因此，本研究旨在观察活血化痰方的降脂效果及探索其降脂的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取36只SPF级别SD雄性大鼠，180～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK2017-0005），所有大鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心。饲养环境干燥、通风，温度20～26℃，湿度40%～70%。高脂饲料配方：78.8%繁殖鼠料、10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐。由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证号：苏饲证（2014）01008。

1.2 试剂与仪器 活血化痰方水煎液：委托上海中医药大学附属曙光医院制剂科采购中药并制备水煎液。可定［阿斯利康药业（中国）有限公司，批号：132756］。试剂：总胆固醇（TC）测定试剂盒、三酰甘油（TAG）测定试剂盒、LDL-C测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒、血清前蛋白枯草酶溶菌素9（PCSK9）酶联免疫试剂盒、血浆卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）酶联免疫试剂盒、胆固醇酯转移蛋白（CETP）酶联免疫试剂盒和肝脂酶（HL）酶联免疫试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。仪器：Beckman coulter离心机 （美国贝克曼）；高速冷冻离心机（Neofuge13R，Heal Force）；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶标仪 （芬兰制造）；Mettler-Toledc电子天平 （上海梅特勒-托仪多公司）；动物手术器械（上海玉研科学仪器有限公司）；10%甲醛（上海榕柏生物技术有限公司，批号：RS-40371）；石蜡切片机（上海榕柏生物技术有限公司）；光学显微镜（上海思长约光学仪器有限公司）；涡旋振荡器 votex-2（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；15 mL硅化离心管（corning）；10 mL无菌注射器 （上海康莱德企业发展集团股份有限公司）。

1.3 实验方法 SD大鼠36只据体质量和随机数字表完全随机区组分组，共分为6组（n=6）：空白组、模型组、可定组、活血化痰方低剂量组、活血化痰方等效剂量组、活血化痰方+可定组。空白组予基础饲料，其余各组均予高脂饲料（10 g饲料/100 g）。造模的同时各药物组按人-动物药物剂量换算表分别给予相应药物灌胃，灌胃剂量：可定组（0.76 mg/kg）、活血化痰方低剂量组（3.5 g/kg）、活血化痰方等效剂量组（14 g/kg）、活血化痰方+可定组（活血化痰方14 g/kg，可定0.76 mg/kg），空白组和模型组分别给予等量蒸馏水灌胃。各组动物均自由饮水摄食，每周称体质量1次，以调整饲料喂养量及药物灌胃量。实验周期为8周。

1.4 标本采集与检测 喂养8周后，各组动物禁食不禁水12 h，称体质量后行3%戊巴比妥称定质量麻醉，剪开皮肤肌肉，找到腹主动脉，3.8%枸橼酸钠润洗的10 mL注射器，以腹主动分叉处向心端1～3 mm处穿刺取血，取血后3000 r/min，离心10 min后分离血清，-80℃保存备用。处死动物后迅速分离肝脏，在4℃0.9%氯化钠注射液中漂清血水，使用滤纸吸干后浸泡于10%福尔马林备用。采用生化法检测大鼠血清 TAG、TC、HDL-C、LDL-C 的水平；采用 ELISA 法测定PCSK9、LCAT、CETP、HL的水平，以上指标均严格按照试剂盒使用说明书进行操作。肝脏病理：将浸泡于10%甲醛中的肝脏经石蜡包埋切片，常规取材和固定、脱水和包埋、切片及染色等操作后，置于光学显微镜下，以观察各组大鼠肝脏。

1.5 统计学处理 应用SPASS18.0统计软件。结果符合正态分布的数据以（x±s）表示，不符合正态分布的数据用中位数（四分位数间距）［M（Q1，Q3）］表示。 符合正态性及方差齐性组间比较使用单因素方差分析，不符合正态性和 （或）方差齐性组间比较使用非参数检验。P<0.05表示存在统计学差异。

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量比较 见表1。各组间治疗前大鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；8周后，各组间大鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠体质量比较（g，x±s）

2.2 各组大鼠血脂水平比较 见表2。与空白组比较，模型组大鼠血清的 TC、TAG、LDL-C 显著上升（P<0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠血清的TAG、LDL-C均下降（P<0.05）；与模型组比较，可定组与活血化痰方+可定组的TC显著下降（P<0.05）。

表2 各组大鼠血脂水平比较（mmol/L，x±s）

2.3 各组大鼠血脂代谢途径的影响比较 见表3。与模型组相比，活血化痰方低剂量组、活血化痰方等效剂量组、活血化痰方＋可定组的PCSK9均下降（P<0.05），活血化痰方等效剂量组的HL有升高的趋势。

2.4 各组大鼠肝脏组织病理结果 见图1。肉眼观察空白组大鼠肝脏外形正常，包膜光滑，颜色暗红；模型组大鼠肝脏体积明显增大，颜色淡黄，包膜紧张，质地较软，切面有油腻感。光镜下观察，空白组大鼠肝小叶和肝细胞索结构清晰；模型组大鼠肝细胞内出现较多大小不等的脂肪滴，部分肝细胞核被脂肪滴挤压而明显偏位，脂质沉积明显，肝脏脂肪变性程度较为严重；与模型组比较，各药物组肝小叶和肝细胞索结构较为清晰，且肝细胞内脂质沉积和肝脏脂肪变性程度明显减轻；可定组肝脏细胞出现明显的细胞肿胀现象。

表3 各组大鼠血脂代谢途径比较（ng/mL，x±s）

图1 各组肝脏组织结构（HE染色，20倍）

3 讨 论

现代医学在他汀类药物基础上联合应用不同作用机制的降脂药物主要有依折麦布［5］、PCSK9抑制剂、微粒体TAG转移蛋白抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂等，但因其价格昂贵［6］或缺乏临床硬终点的证据［7-8］，短期内无法大量广泛应用于临床。中医药也进行了许多的基础与临床干预研究，如中国冠心病二级预防研究发现采用血脂康常规剂量适度调脂，就可使中国冠心病患者获益［9］。高脂血症的形成与肝脾肾的功能失调密切相关，肝脾肾功能失调为本、痰瘀阻滞为标，本虚标实相互作用形成恶性循环，日久脉络受损，引发心脑血管病。临床上高脂血症患者往往痰浊与血瘀并见［10-11］，故本研究组在“痰瘀同治”的治则下，自拟了“活血化痰方”。

本实验研究结果表明活血化痰方低剂量与等效剂量组均可有效降低高脂血症SD大鼠血清TAG和LDL-C的水平，其疗效与可定一致，活血化痰方与可定联合应用有进一步降低LDL-C水平的趋势。PCSK9是参与胆固醇转运过程的一种重要蛋白酶，可在蛋白水平降低肝细胞表面LDLR的数量，从而降低肝细胞对血液中LDL-C的清除能力，因此抑制PCSK9的活性及表达可降低体内LDL-C的水平。当血液中LDLC水平增加时，肝细胞内LDL-C水平降低，肝细胞表面LDLR的数量减少，从而血清PCSK9的水平会反馈性减少，这与本研究结果一致。他汀在降脂的同时可引起的PCSK9分泌增加，此种效应会降低（至少部分）他汀的疗效［12-14］。在本实验中发现，与单纯可定组相比，活血化痰方＋可定组具有进一步降低LDL-C、PCSK9水平的趋势，这提示活血化痰方可抑制他汀类药物引起的PCSK9反馈性增加，具有潜在增加他汀类药物降脂疗效的作用。

HL是参与脂蛋白代谢过程的关键酶之一，HL活性增强可降低TAG水平［15］。本研究发现：与模型组相比，可定组的HL水平明显降低，中药等效剂量组的HL有升高趋势，而基础研究显示活血化痰方可降低TAG，说明活血化痰方降低TAG的机制可能与升高血清HL水平有关。LCAT、CETP为参与胆固醇逆转运过程的2种重要蛋白，两者活性及表达的增强可促进胆固醇逆转运，降低血液和动脉粥样硬化斑块中的胆固醇［16］。动物实验结果表明，活血化痰方未显示出对LCAT、CETP水平有影响，这与HDL-C的统计分析结果一致。

肝脏是体内脂质代谢的重要场所，各种原因引起脂质代谢紊乱均可导致肝细胞脂质沉积和肝脏脂肪变性。动物实验肝脏病理结果表明活血化痰方可能通过抑制肝脏合成和（或）促进肝脏排泄等途径影响脂质在肝细胞的沉积，是否与调控胆固醇细胞内合成相关的HMGCoA还原酶，与胆固醇肝脏排泄相关的胆固醇-7α 羟化酶（CYP7A1）［17］等的表达有关，尚需进一步通过实验验证。

综上，本研究认为活血化痰方能有效降低高脂血症大鼠血清LDL-C、TAG水平，与可定的降脂疗效相当，其机制可能分别与其调节血清PCSK9水平、升高血清HL水平有关，同时活血化痰方能够显著改善高脂血症大鼠肝脏的脂质沉积。但活血化痰方调节血脂的确切机制尚需进一步的研究，以明确其更有效的作用靶点。