徐 兵 ，冯兆光 ，刘 凯 ，李小东 *

(1.青州市花卉高科技博览园管理委员会，山东 青州262500；2.济南文旅花木开发有限公司，山东 济南 250100)

‘青州仙子’兰（Cymbidium ‘Qingzhou Xianzi’），是以国兰品种企剑白墨为母本、大花蕙兰品种金为父本，经过杂交选育的品种，2014年培育成功，2016年通过专家审定，认定为山东省林木良种，并大量生产推广。其株型直立紧凑，叶形飘逸，着花可达15朵以上，花径6.3 cm，浅黄绿色，唇瓣微向后卷，带清香。抗病性强，易栽培，适应性广。从试管苗移栽到开花约需30个月，适合温室养护，在山东省温室栽培不需要高山催花就能在春节期间开花，花期长达50 d，具有较强的观赏价值，适合大面积推广应用。本研究以‘青州仙子’兰侧芽为材料，研究组织培养获得再生苗的方法，建立再生体系，为实现工厂化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 取材及消毒

供试材料为‘青州仙子’兰的春生侧芽，取材前以多菌灵灌根，并严格浇水方式，避免浇到新芽上。切取5～6 cm的侧芽，切除根部，剥去部分叶片，用洗衣粉水轻轻洗净表面[1]，在超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞浸泡，设置不同消毒时间 8 s，10 s，12 s，14 s，16 s，然后用无菌水洗 5次，每次5 min，剥去外层叶片后，切除底部褐化部分，接种到诱导培养基中，一月后统计污染率、褐化率、成活率。

1.2 供试培养基及培养条件

（1）原球茎诱导培养基：1#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.2 g/L；2#MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+AC0.2g/L；3#MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%；

4#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%。

接种完成后分别置于光照和黑暗条件下培养，比较褐化率、诱导率。

（2）原球茎增殖及成苗培养基：

将诱导培养获得的类原球茎块切成直径2～3 mm的小块，一般2个原球茎为一块，接种于增殖及成苗培养基上。筛选培养基采用4因素3水平的L9(34)正交设计（表1），每个处理接种6瓶，每瓶接种5组原球茎，重复3次，60 d后统计原球茎增殖率及成苗率。

表1 原球茎增殖及成苗培养供试因素及水平

（3）壮苗培养基：

14#MS；

15#1/2MS；

16#1/2MS+NAA0.2mg/L；

17#1/2MS+AC0.5mg/L；

18#1/2MS+AC0.5mg/L+香蕉泥50g/L。

将增殖及成苗培养获得的小苗 (高度3 cm左右)接种于壮苗培养基上，研究MS培养基含量、NAA、AC、香蕉泥在壮苗培养中的作用。每个处理接种3瓶，每瓶接种10棵小苗，重复3次，80 d后统计壮苗效果、7 cm以上苗的数量。

（4）生根培养基：

19#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L+香蕉泥50 g/L；

20#1/2MS+NAA.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L；

21#1/2MS+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥50 g/L。

将壮苗培养基中获得的高度7 cm以上的组培苗切除原有根系，接种到生根培养基中，研究NAA、AC、香蕉泥相互租用对生根情况的影响，60 d后统计生根率。

上述培养基 pH5.8，琼脂为 6 g/L，蔗糖 30 g，于121℃杀菌 20 min。

（5）培养条件：培养温度 25℃±1℃，光照 12 h/d，光源由LED灯提供[2]，光照强度1500 Lx。

2 结果与分析

2.1 最佳消毒时间

消毒前对侧芽严格进行预处理对消毒效果影响很大，4 cm以下未展开叶的侧芽由于木质化程度较低，易被消毒液杀死；7 cm以上展开叶的侧芽由于叶芯难以消毒彻底，一般污染率较高。5～6 cm未展开叶的侧芽已具有一定程度的木质化，抗消毒能力强，若无机械损伤，叶芯基本无菌，故消毒成功率较高。通过对消毒时间的比较，升汞消毒10 min，无论从污染率还是褐化率上来说，都相对较低，并且侧芽变绿快，成功率较高，随着消毒时间延长，侧芽因褐化而死亡迅速增多，因此确定升汞最佳消毒时间为10 min（表2）。通过对比发现，黑暗培养虽然在一定程度上能减轻褐化，但不利于芽体变绿，脱分化较慢。

表2 消毒时间对成活率的影响

2.1 原球茎诱导培养

将侧芽接种到原球茎诱导培养基，7 d后开始恢复生长，芯叶开始变绿，随后整个侧芽逐渐变绿，并有原球茎分化生长。BA、NAA浓度较高，则分化较快；BA、NAA浓度降低后，侧芽膨大，分化较慢。AC 0.2 g/L在一定程度上能抑制褐化，但总体效果不如添加10%椰汁，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+椰汁10%，60 d分化率最高75%，几乎不出现褐化（表3）。

表3 原球茎诱导培养结果

2.2 原球茎增殖及成苗培养

将诱导获得的原球茎转接到增殖及成苗培养基中，60 d转接一次，原球茎最高增殖倍数为6.9倍，每组原球茎最高可平均再生1.4棵苗。无机盐含量的增加可提高原球茎的增殖倍数，BA/NAA比值增大，原球茎增殖倍数提高，BA/NAA比值达到20以上时，褐化严重原球茎死亡较多，再生苗矮化。适当添加AC可降低褐化率，增加成苗率，AC过高会降低原球茎增殖倍数，相比之下AC 0.2 g/L既能达到防止褐化的效果，对原球茎增殖影响较小。对比之下最适宜原球茎增殖同时成苗的培养基为6#MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 0.2 g/L（表4），具有较高的增殖率和成苗率，苗壮，适宜进一步壮苗生根。

表4 原球茎增殖及成苗培养结果

2.3 壮苗培养

表5 壮苗培养结果

选取高度3 cm左右的小苗，接种到壮苗培养基中。15 d后开始有可见根长出，添加NAA的培养基生根快，并且30 d后生根数最多、根长度最大，有白色根毛生长，苗生长不足，不利于壮苗。培养基中无机盐含量高容易导致原球茎增殖，MS比1/2MS培养基生长更过的原球茎。添加AC，苗生长快，可能与AC能吸收苗内残留的细胞分裂素有关[3]，正是由于这方面的原因，AC可作为组培壮苗的有效添加物。添加香蕉泥，大约30 d才有根生长，壮苗效果好，苗粗壮，80 d后根数可达到2条，因此最佳壮苗培养基为18#1/2MS+AC 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L（表 5）。

图1 壮苗培养

2.4 生根培养

表6 生根培养结果

选取7 cm以上的壮苗接种到生根培养基中，多数苗在15 d后开始有可见根。通过前期研究认为，添加香蕉泥对AC具有沉降作用，大部分活性炭会沉到瓶底，活性炭对NAA的吸附作用也比较明显，但添加NAA 0.5 mg/L以上时，几乎所有的苗都能生根，但AC 0.5 g/L以下时NAA作用较明显，根系生长快、根多、过长。NAA 1.0 mg/L、AC 1.0 g/L以上时，生根条数、生根率变化不大，跟系不够粗壮，90 d后在瓶内盘织交错，不利于出瓶。从生根数、生根率、根的长度等方面综合考虑最佳生根培养基为20#1/2MS+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉泥 50 g/L（表 6）。

2.5 炼苗移栽

生根培养90 d以上、苗高15 cm以上时要及时练苗移栽，否则可能会因营养不足导致黄叶等。在散射光下（光照强度1500 Lx）培养20 d左右，开盖4 d后移栽。洗净根部残留的培养基，用干净的小颗粒松树皮包裹移栽到7 cm营养钵中。把握好干透浇透的浇水原则，20 d内光照控制在5000 Lx以下，每天喷雾2次，以后逐渐增加光照，进行常规管理，成活率90%以上。

3 讨论

图2 移栽

相对于大花蕙兰和国兰，杂交兰具有花香、株高适中、价格合理、易养等优势，近年来颇受消费者欢迎，尤其是素花品种，更显淡雅、更具清韵。本研究以青州自育品种‘青州仙子’兰为实验材料，具体研究其工厂化快繁技术，取得明显成效。结果表明，选取5～6 cm未展开叶的春生侧芽消毒成活率最高，添加10%椰汁对原球茎的诱导具有明显的促进作用，添加活性炭对壮苗培养有利。研究表明，在‘青州仙子’兰的工厂化快繁中，壮苗培养不可少，经过壮苗培养的兰苗，生根快、苗壮、成活率高，温室养护过程中生长快，抗病能力强，催花质量好。值得一提的是‘青州仙子’兰以墨兰为母本、但以原球茎方式增殖，这与墨兰以根状茎方式增殖有明显不同，可见父本的增殖方式对其增殖方式影响力之大，影响兰花增殖途径的因素有待于进一步研究。