冷晓燕，段云飞，段颖，徐燕，常菁

江苏迈健生物科技发展股份有限公司，江苏 无锡 214000

创面愈合是一个复杂的过程，涉及皮肤缺损部位的再上皮化、肉芽组织的增生、炎症反应、血管增生和创面重塑等，其中任何一个过程出现问题，都会导致创面愈合障碍[1-2]。在创面愈合过程中，生长因子扮演着非常重要的角色，这是由于它们在体外具有独特的、能够刺激静止期细胞持续进行有丝分裂的能力，在这一复杂的过程中，生长因子的调控非常精细，它们能对伤口愈合的各个时期产生影响，从而加快愈合速度[3]。然而，应用高剂量单一因子治疗难愈性创面虽然能在一定程度上缓解患者病情，但调控机制单一，且价格昂贵，因此限制了其临床应用。有学者对脐带来源的干细胞上清液中的成分进行了液相色谱-质谱联用（LC-MS）实验分析，结果表明该上清液中含有多种细胞因子，如大量的IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF、TGF-β1等[4]，这些因子在创面愈合过程中非常重要。

本实验中，我们将人脐带间充质干细胞（hu⁃man umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）上清凝胶直接作用于活体创面，观察是否会影响创面的再次上皮化、肉芽组织增生、炎症反应、血管增生和创面重塑等过程，探讨干细胞上清对小鼠创面愈合的影响，研究hUC-MSCs上清与动物创面愈合的关系，以及促进创面愈合的合理蛋白含量，旨在为临床促进创面愈合寻找新的药物和新的治疗方法。

1 材料和方法

1.1 材料

健康新生儿脐带取自解放军101医院妇产科足月剖宫产的胎儿；雌性ICR小鼠40只，体质量25～30 g，由苏州大学实验动物中心提供；α-MEM、胎牛血清（FBS）（BI公司）；CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR单克隆抗体（BD公司）；RNA Simple Total RNA kit、Quantscript RT kit（大连宝生物公司）；动物组织总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（天根公司）；常规生化试剂均为国产分析纯产品；流式细胞仪（BD公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 hUC-MSCs的分离培养

从手术室取得新鲜健康新生儿脐带，用PBS冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养，培养液中含10% FBS，待细胞长满后，用0.25% 胰蛋白酶消化传代。

1.3 流式细胞仪检测

将原代细胞消化下来后，加PBS调整细胞浓度至1×106/mL，取200 μL细胞悬液按组合方案分别加入5 μL荧光标记的单抗（CD90-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE）混匀，室温避光孵育20 min，上机检测。

1.4 成骨成脂细胞分化

取第3代细胞消化传代后，以约1.0×105/孔接种到6孔板中，成脂、成骨分化及对照各2孔，待细胞贴壁后，向分化组加入相应的分化培养液。成骨分化培养基中含1.0×10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L β磷酸甘油；成脂分化培养基中含10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、50 μg/mL抗坏血酸、10 μg/mL胰岛素注射液、0.2 mmol/L吲哚美辛。每3～4 d换液1次，分化4周后，用4% 低聚甲醛将细胞固定，分别用茜素红染液和油红O染色，苏木精复染，于显微镜下观察。

1.5 RT-PCR检测Oct4、Sox2的表达

直接向6孔板的每孔细胞内加1 mL TRN⁃zol，吹打混匀后用氯仿-异丙醇法提取总RNA，采用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA。PCR引物见表1。反应条件：95℃ 5 min，以95℃变性30 s、不同温度退火30 s、72℃延伸30 s行35个循环，72℃延伸10 min。

1.6 hUC-MSCs上清液的收集

当第3代细胞长至70% 汇合度时，用不含血清的干细胞培养基（α-MEM）培养48 h，收集细胞上清液，用蛋白电泳方法检测胎牛血清残留量，以将胎牛血清耗尽的培养时间为止，将收集的液体1000 r/min离心5 min，分装到15 mL离心管中，-80℃冻存备用。

1.7 hUC-MSCs上清液粗提纯及总蛋白浓度检测

采用硫酸铵沉淀法进行盐析，收集蛋白沉淀，加水溶解后过滤，将葡聚糖凝胶柱G-25（5 cm×60 cm）连接AKTA蛋白纯化仪，用含0.15 mol/L NaCl的去离子水作为洗脱剂，对溶液进行过滤除盐、脱色处理。将收集到的样品用0.22 μm滤膜过滤后于4℃保存。总蛋白浓度检测采用BCA法。

表1 GAPDH、Oct4、Sox2引物序列

1.8 凝胶剂的制备

将收集到的纯化上清用冻干机冻干成粉，用无菌水将冻干粉溶解为浓度19 g/L的蛋白凝缩液。3% 甲基纤维素（MC）与1.3 g/L纯化上清等体积混合即为低剂量凝胶剂，3% MC与19 g/L纯化上清（冻干浓缩而成）等体积混合即为高剂量凝胶剂。

1.9 小鼠皮肤损伤模型的建立

将ICR小鼠用4% 水合氯醛麻醉，用剃毛器除去背部被毛，采用5 mm皮肤打孔器于小鼠背部制备2个对称的皮肤创伤模型。将实验动物随机分成空白对照组（10只，实验期间伤口不给予任何处理）、溶剂对照组（10只，实验期间伤口给予3% 甲基纤维素处理）、实验材料组［共20只，分为Ⅰ组（10只，实验期间伤口给予低剂量凝胶剂处理）、Ⅱ组（10只，实验期间伤口给予高剂量凝胶剂处理）］。

1.10 创面愈合率

进行上述实验后小鼠分笼饲养，每天观察进食情况、创面变化及愈合情况，计算创面愈合率。

1.11 组织学分析

第3、6、8、15 d留取各组切口处含两侧1 cm范围圈层皮肤组织制作石蜡切片，HE染色，评估不同组别切口愈合的大体情况。第3、6、8、15 d留取各组切口处含两侧1 cm范围圈层皮肤组织制作石蜡切片，Masson三色染色，评估不同组别切口愈合过程中胶原形成的大体情况。

1.12 愈合组织相关因子表达的检测

白细胞介素1β（IL-1β）是具有代表性的炎性因子，成纤维细胞生长因子β1（TGF-β1）是成纤维细胞的强力生长因子，VEGF为血管内皮生长因子。另外，Ⅰ型胶原（Col1）是机体主要的结构胶原，由2条α1链（Col1a1）和1条α2链（Col1a2）组成三螺旋结构[5]。Col1a1在Ⅰ型胶原合成过程中起着极其重要的作用，而皮肤创伤愈合过程也与胶原纤维的形成息息相关[6]。我们采用动物组织总RNA提取试剂盒提取愈合组织总mRNA，用反转录试剂盒构建cDNA文库。Q-PCR检测则借助荧光定量PCR试剂盒，设置程序：95℃预变性15 min；95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s，40次循环；扩增反应完成后进行熔解曲线制作，确保扩增的特异性。引物序列见表2。

表2 TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β、β-actin引物序列

2 结果

2.1 细胞增殖形态改变

脐带组织培养5～7 d后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，1周后细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，10 d左右去掉组织块，15 d左右可铺满培养瓶的90% 。传代后的细胞呈纤维状生长，如图1。

图1 第3代hUC-MSCs（100×）

2.2 流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果显示，hUC-MSCs高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、HLADR（图2）。

图2 流式细胞仪鉴定原代hUC-MSCs表面标志物的表达

2.3 成骨成脂分化

成脂诱导分化1周后，显微镜下可见胞质内有少量脂滴形成，4周后，油红O染色可见胞质内有较多油滴空泡；成骨分化4周后，细胞大量重叠成团处被染成深红色的“钙结节”（图3）。

图3 hUC-MSCs成脂（A）和成骨（B）体外诱导分化

2.4 Oct4、Sox2的表达

RT-PCR后电泳检测显示，第2代和第5代hUC-MSCs都表达Oct4和Sox2（图4）。Oct4、Sox2是胚胎干细胞表面标志基因，对维持干细胞特性具有重要作用，表明hUC-MSCs具有干细胞特性。

2.5 术后小鼠创面的愈合情况

2.5.1 小鼠皮肤创面的宏观所见 打孔造模当天，创口边缘整齐，伤口红肿，可见明显出血及渗液，创口较为湿润；第1 d，创口已无渗血、渗液，创口皮肤干燥，大部分小鼠伤口可见一层膜状物，少数已结痂；第2 d，各组小鼠伤口均可见完整痂皮覆盖，颜色较浅，质地较软；第3 d，伤口边缘开始收缩，起皱，伤口周围红肿消退；第4 d，痂皮颜色普遍加深，伤口面积明显缩小；第5～7 d，痂皮与创缘皮肤分离，部分已剥脱，创口表面由增生的上皮覆盖，伤口面积进一步缩小；第8～9 d，痂皮陆续脱落，愈合程度快慢不一；第10 d，所有小鼠痂皮都已脱落，伤口呈线形愈合，明显短缩；第15 d，创口已完全愈合，部分小鼠创口皮肤稍隆起，质地较韧。

2.5.2 创面愈合时间和创面愈合率 每天观察各组动物的创面愈合情况，以完全上皮覆盖作为创面愈合时间的依据。每组于伤后1、3、5、7、9 d随机取5只ICR小鼠进行创面拍照（图5），用Im⁃age J图像分析软件，用手动方式标记未愈合创面的边缘，运用软件自动算出愈合创面的大小。创面愈合率=（最初创面大小-未愈合创面大小）/最初创面大小×100% 。不同时间点的创面愈合率见表3，将不同时间点的3组创面愈合率分别与空白对照组进行配对t检验，高剂量组于创伤后第5 d创面愈合率为67.1% ±6.6% ，第7 d为78.1% ±5.8% ，均分别显著高于空白对照组第5 d（58.6% ±12.6% ）和第7 d（71.8% ±9.2% ），差异有统计学意义（P＜0.05），第3、9 d的创面愈合率无明显差别。

图4 hUC-MSCs的Oct4和Sox2基因RT-PCR检测结果电泳图

图5 小鼠皮肤创面愈合情况

2.6 组织学分析

2.6.1 HE染色 常规HE染色可见，第3 d血痂与已经增厚的创缘皮肤分离，创面可见明显的肉芽组织形成，梭形成纤维细胞开始增生，各组差异不明显；第6 d实验组成纤维细胞数量较对照组多，总体来说细胞数量减少，各组小鼠伤口处仍有厚痂，但已开始剥离伤口；第8 d创面周围明显上皮化，创面面积明显缩小，实验组（高剂量和低剂量组）已填满整个伤口区域，对照组可见肉芽组织形成，但不完整；第15 d创口（图6）基本愈合，原先的创口已完全被表皮覆盖，表皮均质变薄，低剂量组伤口宽度明显小于对照组，高剂量组伤口处细胞层次变多，更接近于正常皮肤组织，少数高剂量组个体伤口处出现毛囊汗腺等皮肤附属器官。

2.6.2 Masson染色 创面新生组织切片经Masson三色染色后观察，伤后3～8 d出现肉芽组织，胶原纤维增生不明显；伤后15 d，胶原纤维增生显著（图7，箭头示胶原纤维，呈蓝色）。空白组和MC组术后15 d，新生真皮胶原积累松散，多呈弥漫状，规则积累的胶原蛋白较少。低剂量和高剂量组真皮有粗大并明显走向的胶原纤维，真皮胶原积累优于对照组。

2.7 分子水平检测愈合组织相关因子的表达

实时定量PCR检测小鼠皮肤切创伤口组织中TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因的相对表达量，结果见图8。伤后第2 d，高剂量上清处理的小鼠伤口组织TGF-β1和Col1a1基因表达增加，明显多于对照组（P＜0.05），到第3 d时降至正常水平，与空白对照组相比无显著差异。此外，伤后第3 d，实验组（高剂量和低剂量组）VEGF的表达量均高于对照组，其差异有统计学意义（P＜0.05）。而IL-1β基因的表达，可以看到高剂量组从第3 d开始显著低于空白对照组，其差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不同时间点ICR小鼠创面愈合率（% ）

3 讨论

研究表明，机体组织在损伤的每个时期都有不同的细胞因子在发挥作用，如引起组织收缩、诱导炎性细胞浸润、决定浸润炎症细胞的种类、调节炎症反应的程度、诱导纤维母细胞分化及肉芽组织形成、诱导上皮组织形成等。因此，检测对照组与实验组损伤处组织中各种与损伤修复相关细胞因子的表达情况可以反映出创伤愈合的作用机制，即通过什么途径促进伤口愈合[7]。通过创面愈合率的计算，我们发现伤后的初期和后期，各组小鼠伤口面积差异不明显，伤口愈合依赖于各基因表达产物来有序调控，而表达产物的积累需要一定的时间，所以早期高剂量组和对照组伤口愈合率无差异，而小鼠皮肤自身具有很强的修复能力，到了后期，即便对照组伤口也已基本愈合，所以9 d时高剂量组与对照组也无明显差异。在3～9 d之间，高剂量组的优势在外观上得以显示，愈合率显著高于空白对照组。病理切片使我们能够观察到伤口深层次的变化，初期各组病理形态大体相同，此后实验组同期的修复情况要好于对照组，体现在成纤维细胞数量更多，肉芽组织出现得更早更明显。Masson染色可以帮助我们更好地观察胶原纤维的积累，蓝色越深代表胶原纤维越多。已有研究证实，VEGF可以促进炎性细胞的聚集，刺激多种炎性分子的释放，提高血管的通透性，从而加重炎性反应。而持续的炎性反应可能刺激成纤维细胞增殖和分泌大量的胶原，从而促进了病理性瘢痕的形成。在15 d的Masson病理切片上，我们看到实验组的蓝色更深，胶原的积累是瘢痕形成的物质基础[8]，我们处死小鼠前还未见到伤口出现明显的瘢痕疙瘩，因为事实上瘢痕的形成需要更长的时间。

图6 小鼠皮肤创面愈合15 d（HE染色，箭头示创面位置）

图7 小鼠皮肤创面愈合15 d（Masson染色）

图8 实时定量PCR检测伤后不同时间点TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因表达水平变化

由实时定量PCR结果，可以推测在小鼠皮肤创伤发生后的早期，也就是第2～3 d，我们制备的干细胞上清凝胶促进了TGF-β1、Col1a1、VEGF基因的表达。TGF-β1能直接刺激成纤维细胞外基质蛋白（包括纤维连接蛋白）、胶原、氨基葡糖等的合成，并对新合成的细胞基质的降解具有明显的抑制作用；局部注射TGF-β1可以促进伤口愈合和典型肉芽组织形成[9]。TGF-β1作为趋化因子，推动成纤维细胞生长、胶原积累。Col1a1表达量增加又进一步加速了胶原的形成。创伤修复须经历炎性反应、肉芽组织形成及组织重塑等主要阶段，每一阶段都有血管及其相关生物活性物质的参与，新生血管对于创面愈合起着至关重要的作用，为快速生长的细胞提供氧气和营养支持，以促进创伤组织的修复[8]。VEGF与肉芽组织中血管内皮细胞上的血管内皮细胞因子受体作用，促进内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管构建和生成。在造模后3 d，我们从病理切片上确实观察到此时大量肉芽组织形成和成纤维细胞的聚集，与实时定量PCR结果相印证。这些作用都加快了实验组，特别是高剂量组小鼠创面的修复速率。同时我们还发现，创伤修复后期，高剂量组的IL-1β这一炎症因子表达水平降低。已有研究表明，小鼠皮肤创伤愈合初期，伤口出现大量炎性细胞浸润，随着伤口愈合，炎性细胞逐渐减少直至消失[10]。据此推测，高剂量的hUC-MSCs上清凝胶加速了伤口愈合，使得炎症反应提前消退，炎性细胞在高剂量组小鼠伤口组织中更早消失。本实验初步证实了人脐带来源干细胞上清凝胶能够有效加速小鼠皮肤创面愈合，但其具体机制还须深入研究。