李彬，自加吉，孙美涛，王唯斯，张若鹏，严长宝，熊伟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.大理大学第一附属医院 生殖医学科，云南 大理 671000；3.大理白族自治州第一人民医院 病理科，云南 大理 671000

子宫内膜癌是子宫内膜上皮细胞发生的恶性肿瘤，多见于50岁以上绝经期和绝经期后妇女，以50～59岁为发病高峰，近年来发病率呈上升趋势，病死率高，危害性大[1]。子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，每年有近20万的新发病例，在常见妇科恶性肿瘤中病死率仅次于卵巢癌和宫颈癌[1]。其发病与生活方式密切相关，发病率在各地区有差异，在北美和欧洲发病率仅次于乳腺癌、肺癌、结直肠癌，高居女性生殖系统癌症的首位[2]。在我国，随着社会的发展和经济条件的改善，子宫内膜癌的发病率亦逐年升高，目前仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位[3]。因此，寻找与子宫内膜癌发生发展和预后相关的关键基因，对于子宫内膜癌术后复发的检测和增加新的药物治疗靶点具有重要意义。

子宫内膜癌的生物学特性不仅取决于核内遗传物质，与核外的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）也有一定的关系[4]。线粒体转录终止因子（mitochondrial transcription termination fac⁃tor，MTERF）是一类由核基因编码，通过特殊方式转运到线粒体，并能与mtDNA特异结合的蛋白质，在mtDNA的复制、转录及翻译中发挥调控作用[5]。MTERF家族有4个成员，其中MTERF2又称线粒体转录终止因子D3（MTERFD3）或线粒体转录终止样因子（mitochondrial transcription termina⁃tion-like factor，MTERFL）[6-7]。MTERF2基因是在比较正常血清培养与血清饥饿培养的人成纤维细胞基因表达谱差异时发现的一个细胞增殖抑制基因[7]。人MTERF2基因位于染色体12q23.3，可编码由385个氨基酸残基构成的蛋白质，定位于线粒体内[8-9]。研究表明，MTERF2蛋白在线粒体内的含量相对丰富，是线粒体拟核的重要组成成分[10]。人MTERF2蛋白在体内与mtDNA的结合没有序列特异性，主要参与线粒体基因的表达调控和维持线粒体基因组的稳定性[11-13]。目前，对于MTERF2基因在子宫内膜癌发生发展中的作用及其机制尚未见报道。我们拟利用现有的肿瘤生物信息数据库，通过数据挖掘分析MTERF2基因在子宫内膜癌中的表达及其预后意义。

1 材料与方法

1.1 Oncomine数据库分析MTERF2基因DNA拷贝数在子宫内膜癌中的变化

设置的Oncomine数据库（http://www.oncomine.org）筛选条件为：①Gene：MTERFD3；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Other Cancer；④Date Type：DNA copy number；⑤Simple Type：Clinical Specimen；⑥临界值设定条件：P＜1E-4，fold change 2，gene rank=top 10% 。

1.2 cBioportal数据库分析MTERF2基因在子宫内膜癌中的突变情况

通过cBioportal在线工具（http://www.cbioportal.org）分析MTERF2基因在子宫内膜癌组织中的突变情况。数据库类型选择“TCGA，Provisional”，肿瘤类型选择“endometrial carcinoma”，数据类型选择“Mutation and CNA”，基因选择“MTERF2”。

1.3 GEPIA数据库分析MTERF2基因在各肿瘤组织中的表达

通过基因表达谱动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）数据库，分析MTERF2基因在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中的表达差异，以及人体其他肿瘤组织及其相应正常组织中MTERF2基因的表达差异。

1.4 MethHC数据库分析MTERF2基因在子宫内膜癌中的甲基化水平

通过MethHC数据库（http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw）分析MTERF2基因在子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中的甲基化水平。

1.5 OncoLnc数据库分析MTERF2基因的表达水平与子宫内膜癌患者预后的关系

从OncoLnc数据库（https://www.oncolnc.org）选择在TCGA子宫内膜癌数据样本中的项目，输入MTERF2基因，高表达组与低表达组都设置为33% ，最终得到178例MTERF2基因高表达和178例MTERF2基因低表达样本进行Kaplan-Meier生存分析。

1.6 MTERF2相互作用基因的初探

利用String-DB数据库（https://string-db.org）分析MTERF2基因在mtDNA转录调节中相互作用的基因，并进行基因功能富集分析。

1.7 统计学分析

正常子宫内膜组织和对应的子宫内膜癌组织之间MTERF2基因mRNA表达差异采用t检验。多组样本均数采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用LSD法。MTERF2基因mRNA表达水平与子宫内膜癌患者预后的关系采用Ka⁃plan-Meier模型进行生存分析和Log-Rank检验。统计学分析采用Graphpad Prism 7.0进行，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.005为差异极显著。

2 结果

2.1 MTERF2基因DNA拷贝数与子宫内膜癌的相关性。

Oncomine数据库检索结果显示，有关子宫内膜癌的研究共包括726个样本。与正常子宫内膜组织相比，MTERF2基因DNA拷贝数在子宫内膜样腺癌、子宫内膜混合性腺癌和子宫内膜浆液性腺癌中的表达均没有显著差异（P＞0.05）（图1）。

图1 正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中MTERF2基因DNA拷贝数差异

2.2 子宫内膜癌组织中MTERF2基因的突变

cBioportal在线分析发现，MTERF2基因编码的蛋白质由385个氨基酸残基构成，包含mTERF基序。MTERF2基因在子宫内膜癌组织中存在错义突变和无义突变2种突变类型。在子宫内膜癌组织中，MTERF2蛋白56位的丝氨酸发生无义突变；错义突变分别为33位和136位的苯丙氨酸转变为亮氨酸（F33L和F136L），255位的亮氨酸转变为异亮氨酸（L255I），379位的丙氨酸转变为谷氨酸（A379E）。结果见图2。

图2 子宫内膜癌组织中MTERF2基因的突变

2.3 人体各种肿瘤组织及其相应正常组织中MTERF2基因的表达差异

通过GEPIA分析TCGA子宫内膜癌数据集，该数据集中包括306例宫颈癌组织样本和13例正常宫颈组织样本。结果同样显示，与正常子宫内膜组织相比，MTERF2基因在子宫内膜癌组织中低表达，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。GEPIA分析TCGA数据库中MTERF2基因在人体31种肿瘤组织及其相应的正常组织中的表达差异，结果显示，MTERF2在大多数肿瘤组织中均呈低表达，但在胆管癌（CHOL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、低级别胶质瘤（LGG）和胸腺瘤（THYM）中，MTERF2表达水平比其相应的正常组织中的表达水平增高（图4）。

图3 TCGA数据集中子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中MTERF2基因mRNA表达差异（*P＜0.05）

图4 人体各种肿瘤组织及其相应的正常组织中MTERF2基因的表达差异

2.4 子宫内膜癌中MTERF2基因DNA启动子区甲基化水平分析

在MethHC中，MTERF2基因的转录模板是NM_001033050，与NCBI数据库报道的一致。研究发现，子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中MTERF2基因DNA启动子区的甲基化水平差异明显，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中NM_001033050表达降低，MTERF2基因启动子区甲基化水平显著降低（P＜0.005）（图5）。结果提示，MTERF2基因DNA启动子区甲基化水平是影响其在子宫内膜癌中表达水平的因素之一，但可能还存在其他表观遗传学因素能影响MTERF2基因的表达。

2.5 MTERF2表达水平对子宫内膜癌患者预后的Kaplan-Meier生存分析

对OncoLnc数据库中子宫内膜癌数据集进行Kaplan-Meier分析，结果显示MTERF2基因mRNA的表达水平对子宫内膜癌患者的总生存时间无显著影响。与高表达组相比，MTERF2基因低表达组的子宫内膜癌患者总体生存率无明显变化（Log-RankP=0.775）（图6）。

2.6 与MTERF2相互作用的基因及基因功能富集分析

String-DB分析表明MTERF2基因在线粒体基因转录过程中处于重要位置，PPI富集P=2.59e-5，节点数为11个，与MTERF2相互作用的基因包括线粒体转录因子B1（mitochondrial transcription factor B1，TFB1M）和B2（TFB2M）、线粒体转录终止因子结构域 1（mitochondrial transcription termi⁃nation factor domain containing 1，MTERFD1）和 2（MTERFD2）、线粒体RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，POLRMT）、单链DNA结合蛋白1（single-strand DNA-binding protein 1，SSBP1）、细胞色素C氧化酶组装因子3（cytochrome c oxi⁃dase assembly factor 3，COA3）、肝癌衍生生长因子相关蛋白 3（hepatoma-derived growth factor-re⁃lated protein 3，HDGFRP3）等（图7）。与MTERF2有相互作用的基因及其功能富集分析见表1。

表1 与MTERF2基因密切相关的基因及基因功能富集分析

图5 MethHC数据库分析子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中MTERF2基因甲基化水平

图6 OncoLnc数据库子宫内膜癌数据集中MTERF2基因表达量与患者预后的Kaplan-Meier生存分析

3 讨论

Oncomine数据库整合了GEO、TCGA和已发表的文献等来源的DNA和RNA数据，是分析癌症组织和正常组织差异表达的癌症基因芯片数据库[14]。cBioportal在线工具可分析各种基因在各肿瘤组织中的突变情况[15]。GEPIA是北京大学研制开发的可用于分析基因在癌症和正常组织中的差异表达的在线应用，可对TCGA数据库进行可视化分析[16]。MethHC数据库包含18个人类各正常组织和肿瘤组织中的DNA甲基化和mRNA/miRNA表达谱，可用于证明正常和肿瘤组织中的甲基化模式，并分析甲基化和表达之间的相关性，还可用于基因组分析揭示差异甲基化基因和基因簇[17]。OncoLnc数据库可对癌症数据集进行在线Kaplan-Meier生存分析[18]。String-DB数据库是分析基因或蛋白质相互作用的检索工具，包含已证实的和可以预测的蛋白质-蛋白质相互作用的生物数据库和网络资源[19]。

图7 线粒体转录过程中MTERF2基因的位置及其相互作用的基因

恶性肿瘤的发生不仅与核内遗传物质相关，还与核外的mtDNA密切相关。由于mtDNA缺乏组蛋白的保护，无DNA修复系统，处在高氧化应激环境中，容易受电子传递链产生的自由基的损伤，与化学致癌物的亲和力较核基因组高等原因，使mtDNA具有较高的突变率，可能有潜在的致癌性[20]。研究发现，在多种肿瘤组织及其相应的体液标本中存在mtDNA突变，如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和大肠癌等，但不同类型的肿瘤组织中所报道的突变率及突变类型各不相同[21-24]。恶性肿瘤的发生不仅与mtDNA结构改变相关，还与其数量有密切联系。与正常组织相比，不同类型的肿瘤组织中mtDNA数量有不同程度的增多或减少[25]。线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体功能障碍与恶性肿瘤、线粒体糖尿病、神经退行性疾病等的发生密切相关[26]。研究表明，细胞内过表达MTERF2基因显著抑制细胞生长和增殖，细胞周期阻滞于G1/S期，但并不诱导细胞凋亡[7]。MTERF2是调控线粒体基因表达的重要因子，目前MTERF2在子宫内膜癌中的表达及其预后意义尚未见报道。

本研究中，我们首先利用Oncomine数据库分析MTERF2基因在各类型子宫内膜癌组织中的DNA拷贝数变化，发现与正常子宫内膜组织相比，MTERF2基因DNA拷贝数在子宫内膜样腺癌、子宫内膜混合性腺癌和子宫内膜浆液性腺癌中的表达均没有显著差异。接着，我们利用cBiopor⁃tal工具分析MTERF2在子宫内膜癌中的突变情况，通过GEPIA数据库分析MTERF2基因在人体各种肿瘤组织和正常组织中的表达情况。结果表明MTERF2基因在子宫内膜癌组织中呈低表达，说明该基因可能对子宫内膜癌的发生发展具有一定的抑制作用，低表达MTERF2基因会促进子宫内膜癌发生，这有待于进一步的实验证实。然后，又通过MethHC数据库分析子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中MTERF2基因DNA启动子区的甲基化水平的变化。结果显示，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中MTERF2基因启动子区甲基化水平显著降低。提示，除MTERF2基因DNA启动子区甲基化水平外，可能还有其他表观遗传学因素影响MTERF2基因在子宫内膜癌的表达水平。最后，利用Oncolnc数据库分析MTERF2基因表达水平对子宫内膜癌患者总生存时间的影响，发现MTERF2基因高、低表达组的子宫内膜癌患者总体生存率无明显变化。

此外，我们还对MTERF2基因在线粒体基因表达调控中的作用及其密切相关基因进行了初步探索，通过String-DB数据库挖掘发现，MTERF2在线粒体基因转录起始的调控和线粒体基因组维持等过程中具有重要作用，与MTERFD1、MTERFD2、TFB1M、TFB2M、POLRMT、SSBP1、PTCD1、COA3、HDGFRP3等基因关系密切，可能共同调节线粒体DNA的转录。

本研究的优势在于利用各种在线肿瘤生物学数据库，样本量较大，临床数据资料相对完整。而不足之处在于，各个数据集中提供的都是mRNA水平的表达数据，可能无法完全代表MTERF2蛋白水平的表达情况。在后续研究中应该结合Western印迹和免疫组织化学方法进一步分析讨论。本研究为深入探讨MTERF2基因在肿瘤发生发展中的作用及机制奠定了基础，也为肿瘤的靶向治疗提供新思路。