胡桂萍，曹红妹，石旭平，杨帆，施龙清，杜贤明，王军文，邓真华，王礼献，江新凤

1.江西省蚕桑茶叶研究所，江西 南昌 330202；2.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建农林大学 应用生态研究所，福建 福州 350002；3.江西省蚕桑工程技术研究中心，江西 南昌 330202

［关键字］ 不动杆菌；吡虫啉降解菌；重金属离子；降解动力学

吡虫啉是茶叶生产中有效防治茶蚜、假眼小绿叶蝉、茶黄蓟马等害虫的重要杀虫剂。喷洒到茶园的吡虫啉，大约95% 通过蒸腾、挥发、渗透等方式进入茶叶植株和茶园土壤等环境中，有效利用在害虫上的比例很低。另外茶叶具有自身特殊性，茶叶以采叶为主，单位质量表面积大，喷药部位是直接采收，且一年多次采摘，加上农药间隔期短，茶叶上吡虫啉等农药残留量大[1]，同时吡虫啉在茶叶和茶园土的半衰期分别为5.5[2]和10～150 d[3]，因此，茶叶和茶园土壤吡虫啉超标问题频繁出现，也是制约我国茶叶出口的现实问题。

我们通过长期研究发现并优选到多株对吡虫啉等农药有强降解作用的微生物，其中不动杆菌（Acinetobacter）BCL-1在实验室条件下，24 h内对100 mg/g吡虫啉的降解率可达84%[4]。但是降解菌在室外受多种因子协同作用，不仅包括污染物的浓度，还有多类型污染源叠加阻遏，如重金属络合物的生物效应，以及生物因子影响，如环境微生物群落影响等。由于茶树根系长期富铝，根系土壤周围酸化程度高，土壤盐基离子淋溶活性增强[5]。加之茶园系统中物质与能量循环均受自然与人为活性的双重影响形成开放系统，系统中铜、铅、镉等离子的累积量又高[6]，其中红壤发育的土壤中铜含量最高[7]，而铜离子为茶园土壤重金属污染的重要元素[8]。研究表明，土壤中农药残留与土壤重金属污染是协同正相关，而重金属离子对土壤酶活性和微生物酶活力的作用常常呈现正相关[9-10]。

为了实现吡虫啉降解菌BCL-1在茶园环境等室外大田的高效利用，需要对其环境因子影响机理进行预判，尤其是对茶园土壤中重金属离子的影响进行深入探讨，为后续降解菌生物反应器的研制提供参考。江西省茶区是重要的红壤区，土壤酸化严重，铜和镉等重金属含量超标[11-12]。在此，我们主要探讨菌株BCL-1的吡虫啉降解特性，并重点分析铝离子和铜离子影响下的降解菌BCL-1的降解动力学和半衰期等参数，为进一步研制适宜江西红壤茶区茶叶吡虫啉降污剂提供支撑和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

不动杆菌BCL-1分离自茶叶围环境，保存于江西省蚕桑茶叶研究所微生物菌种保藏中心。

吡虫啉标准品（99.8% ）购自国家农药质检中心；氯化钠、硝酸铵、硫酸镁、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、酵母提取物、二氯甲烷、盐酸、甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）均为国产试剂。

液相分析仪（安捷伦1260）；其他设备包括高压锅、超净台、紫外分光光度仪、恒温振荡培养箱、pH酸碱计、旋转蒸发仪、超声波仪、低温高速离心机等。

种子培养基：牛肉膏10.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖5.0 g，加蒸馏水定容到1 L，pH7.2。

基础培养基：NaCl 1.0 g，NH4NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，pH7.0，以吡虫啉作为碳源，浓度视需要添加。

1.2 BCL-1降解吡虫啉动力学研究

将培养好的BCL-1菌悬液，按10% 的比例接种到含100 mg/L吡虫啉的无机盐液体培养基中（pH8.0），30℃、150 r/min培养24 h后，对培养液中的吡虫啉浓度进行0、1、2、3、4、5、6、7 d取样检测，检测菌液的D600nm值及吡虫啉质量浓度，研究菌株BCL-1在不同吡虫啉初始浓度下的生长量及降解率，并计算动力学方程和半衰期。试验设置不接种菌悬液和不含菌体培养基分别作为阳性和阴性对照，每个试验重复3次。

1.3 重金属离子对BCL-1降解吡虫啉的影响

配置浓度为50 mg/kg的铜离子和铝离子母液，然后按比例添加到100 mg/L无机盐液体培养基中，分别制备成 10、50、100、200、500 mg/kg铜离子和 10、50、100、500、1000 mg/kg铝离子浓度的培养基。将新鲜培养的菌体BCL-1细胞按5% 的接种量接种至上述培养基中，25℃、150 r/min摇床培养，24 h后开始取样，每隔24 h取样测定培养液中的吡虫啉浓度，计算降解菌降解率和降解半衰期，所有试验重复3次，以接种灭活的BCL-1为对照。

1.4 吡虫啉浓度检测和分析方法

1.4.1 吡虫啉的提取 取10 mL培养液于50 mL带磨口塞的三角瓶中，加入10 mL二氯甲烷和10 mL盐酸（pH3），盖上瓶塞，超声波提取5 min，吸取下层于新的锥形瓶中，上层清液再加入5 mL二氯甲烷超声波提取2 min，取下层与第一次下层有机相合并，转入干净的旋转蒸发瓶中，调旋转蒸发仪温度至40℃，旋转蒸发干之后，向瓶中加入2 mL色谱级甲醇，旋转摇荡使瓶壁上的残留农药尽量溶解，过0.45 μm有机滤膜，收集溶液于GC小瓶中，高效液相色谱分析菌株对吡虫啉的降解率。

1.4.2 吡虫啉的高效液相色谱检测 安捷伦1260液相色谱仪，UV检测器，检测波长270 nm。色谱柱为 Symmetry C18（0.5 μm×4.5 min×250 mm），流动相为水∶甲醇（20∶80），流速1 mL/min，柱温保持室温，运行10 min，吡虫啉保留时间为3.85 min，进样量10 μL，采用外标法定量测定。

1.4.3 菌液D600nm值的测定 菌液D600nm值为测定值与空白对照值的差值（以未接种菌液的选择性培养基D600nm值作为空白对照值）。

1.5 动力学方程

BCL-1降解吡虫啉的过程用一级反应动力学方程描述，半衰期计算公式如下：

对式两边同时取自然对数：

式中，Ct为t时刻培养基中农药的残留浓度（mg/L）；Co为吡虫啉的初始浓度（mg/L）；k为降解速率常数（d-1）；t为降解时间（d）。

半衰期（t1/2）为农药降解50% 所需时间（d）：

2 结果

2.1 不动杆菌BCL-1的生长特性及其对吡虫啉的降解特性

不动杆菌BCL-1在吡虫啉基础培养基中的生长曲线见图1，符合一元二次回归方程。接种后第4 d菌株生长量达到最高，第5 d后迅速下降。但BCL-1对吡虫啉降解菌的降解率（图2）呈线性上升趋势，第5 d的降解率仅为57.5% ，而第6 d和第7 d更高，分别达到65.7% 和87.9% 。这主要与菌株代谢物生产量和代谢物中的水解酶、氧化还原酶的生成有关，菌株在第5 d虽然生物量最高，但代谢物累积量未达到最高，因此，第6 d和第7 d的吡虫啉降解率更高。

图1 吡虫啉降解菌BCL-1的生长曲线

2.2 不动杆菌BCL-1降解吡虫啉的一级反应动力学和半衰期

通过对不动杆菌BCL-1降解动态进行动力学分析并计算半衰期得到（图3），BCL-1降解吡虫啉的一级反应动力学公式为y=55.175e-0.271x，半衰期为2.56 d，显著低于已报道的茶叶和茶园土中吡虫啉的半衰期，郭冬梅报道的吡虫啉在江西红壤中的半衰期是12.9 d[2]，这为BCL-1在茶产业吡虫啉降污中的开发应用奠定了前景。

2.3 重金属离子对BCL-1降解吡虫啉的影响

菌株BCL-1在添加不同浓度Cu2+的吡虫啉基础培养液中的降解特性见图4。各浓度Cu2+处理下BCL-1对吡虫啉的降解率均与空白对照的变化趋势一致，无差异，均呈现前5 d快速上升达到最高和第6 d缓慢降低的趋势。第5 d，10、50、100、200、500 mg/kg Cu2+作用下的降解率分别为59.84% 、62.49% 、62.96% 、66.26% 、64.84% ，空白对照的降解率为57.52% 。

图2 菌株BCL-1的吡虫啉降解特性

图3 菌株BCL-1降解吡虫啉的动力学模型

往100 mg/L的吡虫啉基础培养液中分别添加10、50、100、500、1000 mg/kg的 Al3+后，动态测定菌株BCL-1对吡虫啉的降解率，结果见图5。与对照相比，添加10、50、100 mg/kg的Al3+后，吡虫啉降解菌同期均比对照高，且与Al3+浓度呈负相关。添加10 mg/kg Al3+的降解率同期最高，第5 d达最高为79.51% ，而对照第5 d也达最高，但降解率仅为57.19% ；次之为50 mg/kg Al3+,降解率第5 d为75.56% ，其次为100 mg/kg Al3+，第5 d的降解率为73.97% 。但500和1000 mg/kg Al3+处理后吡虫啉降解率同期均低于对照，5 d后的降解率分别为34.14% 和36.18% 。可以看出，不同浓度Al3+对吡虫啉降解率有影响，低于100 mg/kg的Al3+可以提高BCL-1对吡虫啉的降解能力，而在高于500 mg/kg Al3+的环境中，BCL-1对吡虫啉的降解能力受到抑制。

2.4 不同重金属离子对菌株BCL-1降解吡虫啉的动力学和半衰期的影响

分析不同浓度Cu2+和Al3+对菌株BCL-1降解吡虫啉的动力学和半衰期的影响，结果见表1。5种浓度 Cu2+（10、50、100、200、500 mg/kg）处理下的半衰期分别为2.16、2.06、2.14、2.08、2.12 d，与空白对照的半衰期2.26 d相比无差异，表明Cu2+对BCL-1的降解作用无影响。而不同浓度Al3+作用下BCL-1的降解动力学和半衰期差异很大，其中10、50、100 mg/kg Al3+处理下的半衰期分别为1.52、1.56、1.75 d，明显低于空白对照的 2.26 d，而500和1000 mg/kg Al3+处理下的半衰期分别为3.67和3.52 d。从半衰期可以看出，Cu2+不影响菌株BCL-1降解吡虫啉的特性，而低浓度的Al3+对BCL-1降解吡虫啉有促进作用，高浓度的Al3+会抑制BCL-1降解吡虫啉的能力。

图4 不同浓度Cu2+对菌株BCL-1降解吡虫啉的影响

图5 不同浓度Al3+对菌株BCL-1降解吡虫啉的影响

表1 不同浓度Cu2+和Al3+作用下BCL-1降解吡虫啉的动力学方程和半衰期

3 讨论

一般而言，强降解效能的菌株具有农药强耐受性和高适应性特性，能以农药作为重要营养源。本研究中的吡虫啉降解菌BCL-1在100 mg/L吡虫啉无机盐中生长旺盛，在第5 d可以达到生长高峰，而降解能力一直持续上升直到第7 d，这与BCL-1在生长过程中产生的分泌物中含有大量降解酶有关。不同的金属离子对不同菌株降解农药的作用方式不同，即使是同一种金属离子，对同一菌株降解不同农药作用的影响也是有差异的[13-14]。金属离子对菌株降解甲胺磷农药有不同程度的促进或抑制作用，Cu2+可以促进菌株HK1降解甲胺磷[15]。同一金属离子对不同菌株降解甲胺磷产生不同的促进或抑制作用，说明不同菌株产生的降解酶系不同。Cu2+抑制嗜麦芽寡养单胞菌1对阿特拉津的降解[16]。但本研究中我们发现，不同浓度的Cu2+对菌株BCL-1降解吡虫啉无影响，半衰期与对照相比也无明显差异，而低于100 mg/L的Al3+可以促进吡虫啉的降解，高于200 mg/kg的Al3+会强烈抑制吡虫啉的降解，说明BCL-1菌株及其酶系作用不受Cu2+的影响，但是与环境的酸碱度影响。茶园根系呼吸作用会分泌大量苹果酸、柠檬酸、草酸等有机酸和多酚类物质，对铝具有很强的络合能力，促进了固定态铝的活化，活化的铝可以吸附羟基或与氢离子交换，高浓度Al3+增进土壤酸化[5]。从这点可以看出，BCL-1及其吡虫啉降解酶系不耐强酸，但不受Cu2+的影响。

茶园土壤是一个多体系复合体，还有大量其他金属离子，如镉离子、汞离子等也是茶园重金属污染的重要元素，这些重金属离子的络合作用对于降解菌有一定的影响[17]，对降解酶有影响[18]，进而影响降解菌的室外投放效能。本研究探讨了Al3+和Cu2+对BCL-1降解吡虫啉的影响，还需对其他影响因素及机制进行多维度分析，才能全面客观地明晰BCL-1降解环境毒物的机制，为BCL-1降污剂产业化提供依据。