马浩天，张宏江，杭伟，崔红利，李润植

(山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801)

近年来，我国的规模化、集约化畜牧养殖业得到了较大的发展，为第一产业的发展提供了强劲的推动力。但是，该模式下，富含氮磷、抗生素以及重金属等污染物质的畜禽粪便大量排入环境，造成了严重的环境生态污染[1]。现今，传统的畜禽废水处理方法存在效率低、成本高和资源化利用增值小等问题。而在实际生产中，大部分的畜禽废水都未经处理，直接排放或者还田，废水中的污染物质迁移入土壤，这些污染物残留在土壤中，也会对植物生长发育及品质造成毒害[2]。另一方面，畜禽废水的直接排放也造成了资源的浪费。

微藻是一类广泛存在于各类水环境中的单细胞微生物，吸收利用N、P能力强。利用微藻净化废水的技术早已引起关注。畜禽废水中大量的氮磷等物质，能够满足微藻对氮源和碳源的需求。废水中的重金属、抗生素等污染物也会被微藻富集和降解[3]。杨坤等[4]通过栅藻(Scenedesmusobliquus)和小球藻(Chlorellavulgaris)对4种养殖废水的净化效果的研究，发现2种微藻对总磷的去除率在 89.32%～98.69%，对硝态氮的去除率也在 60% 以上。Dahmani 等[5]发现小球藻C.pyrenoidosa可去除废水中95%的总氮和81%的总磷。利用畜禽废水培养微藻，还能获得大量的微藻生物质以用于下游产品如生物柴油、功能性饲料等高值产品开发[6]，进而形成基于微藻废水处理联产高值生物化工产品的新型绿色产业链。相关研究发现，微藻在高效去污的同时可以获得较高产量的油脂，例如Li 等[7]发现栅藻Scenedesmussp. LX1不仅可以去除83%～89%的氮和99%的磷，而且藻细胞富集油脂高达生物量的30%～53%。在大多数情况下，畜禽废水中高含量的氮为微藻的生长提供了富余的氮元素，但高N也影响微藻油脂的积累，限氮的环境却有利于微藻细胞积累大量油脂[8]。因此，如何兼顾污水治理效果与微藻油脂的高产率是值得深入研究的问题。

本研究对山西省太谷县当地一养鸡场废水中的N、P等污染物进行了检测，并选用本实验室分离获得的一株能源绿藻即埃氏小球藻(C.emersonii)为试材，分析了该微藻在不同浓度鸡场废水中的生长情况，对不同浓度废水中氮、磷的去除效果，以及微藻细胞油脂合成积累特征。研究表明，埃氏小球藻可在四倍稀释以上的鸡场废水中较快生长，能有效脱氮除磷，且藻细胞油脂合成积累增高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 微藻藻种

本试验所用藻种为山西农业大学分子农业与生物能源研究所分离保存的埃氏小球藻。

1.1.2 鸡场废水与BG-11培养基

鸡场废水采自山西省太谷县某养鸡场，为冲圈废水，于0.45 μm滤膜抽滤后经高压灭菌备用。将灭菌备用的废水原液进行不同倍数稀释后直接用作微藻培养基。对照培养基为BG-11培养基(表1)，调节pH至7.6。

表1 BG-11培养基的成分Table 1 The composition of BG-11 medium

1.2 方法

1.2.1 鸡场废水污染物组分的检测

鸡场废水中总氮(Total nitrogen, TN)和总磷(Total phosphorus, TP)均按照国标HJ636-2012和GB 11893-8的规定，分别采用过硫酸钾消解—紫外分光法和钼酸铵分光光度法测定。化学需氧量(Chemical oxygen demand, COD)采用重铬酸钾氧化法测定。鸡场废水原液中的金属元素经浓HNO3—H2O2消解后，定容至50 mL，采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)，混合标准曲线进行测定。

1.2.2 微藻的培养与生物量测定

将处于对数生长期的埃氏小球藻接入分别含有100 mLBG-11培养基、鸡场废水原液、经灭菌水稀释2倍、4倍、6倍和8倍的鸡场废水的250 mL三角瓶中(共6组处理)，使得每瓶中微藻的细胞浓度为4.0 ×105cells·mL-1，每组处理设置3个重复。接种后，将三角瓶放置于温度25 ℃，光强4 000 lx，光暗比为12 h/12 h的光照培养箱中，持续培养7 d。

微藻生物量采用血球计数板，吸取20 μL含藻水样，经鲁格试剂固定后置于光学显微镜下计数，每24小时取样计数，每个样本计数3次。

1.2.3 微藻油脂含量的测定

微藻细胞总油脂含量测定采用重量法[9]：取适量藻液，10 000 r·min-1离心5 min后弃上清，使用超纯水再次冲洗藻体沉淀，相同条件再次离心5 min，收集藻体沉淀，冷冻干燥制成藻粉；取50 mg藻粉，加入7.5 mL氯仿-甲醇(1∶2，V∶V)溶液，37 ℃下振荡提取24 h，收集上层有机相；藻渣再次用7.5 mL氯仿-甲醇溶液提取，合并2次有机相，加入5 mL氯仿和 9 mL ddH2O，使其比例达到氯仿∶甲醇：水为2∶2∶1.8(V∶V∶V)；离心后收集氯仿相，于氮吹仪上吹干至恒重，得总脂后称重，总油脂重量占藻粉重量的百分比即为油脂含量。

1.2.4 尼罗红荧光染色定性评估藻细胞的油脂积累

取800 μL藻液，加入200 μL二甲基亚砜和10 μL尼罗红丙酮溶液(0.1 g·L-1)，混匀后，于42 ℃水浴加热5 min。选择蓝光为激发光，在荧光显微镜(OLYMPUS, BX53)下观察并拍照藻细胞[10]。

1.2.5 数据处理方法

试验数据重复3次，试验结果使用DPS软件，LSD法分析试验结果在P<0.05水平上是否具有显著性差异，使用Excel 2016软件绘制统计图。

2 结果与分析

2.1 鸡场废水主要污染物及含量

对鸡场废水原液中主要污染物检测(表2， 表3)显示，养鸡废水中的TN、TP和COD含量极高，pH为7.6±0.2偏碱性。根据国家有关行业标准(GB 18596—2001)，TN、TP和COD分别超标30.8、14.22和9.5倍。废水中的含量较高的金属元素有Cr、Cu、K和Na，其中重金属元素Cr超出标准排放量的1.9倍。

2.2 埃氏小球藻在不同浓度鸡场废水中的生长表型

连续7 d对埃氏小球藻在鸡场废水原液及其不同稀释倍数液体中的生长表型进行测试，结果(图1)表明，在培养前3 d内，微藻在BG-11培养基内的生长优于在鸡场废水中的生长。从第4天开始，微藻在8倍稀释的废水中生长迅速，第5天的生物量比前一天增加近1倍，并且此后的2 d内，呈现出高速增长的趋势。从第4天开始，微藻在BG-11培养基和6倍稀释的废水中生长相比，差异不显著(P> 0.05)。然而，微藻在4倍稀释的废水中生长较慢，从第6天开始明显增加，但生物量显著(P< 0.05)低于对照。在2倍稀释的废水和原液中，微藻无法正常生长，甚至出现负增长。推测可能是由于高浓度废水中氨氮含量过高，溶液浑浊，通光率差，造成藻细胞的死亡[11]。而废水稀释后，一定程度上降低了氨氮的含量，提高了溶液的通光率，藻细胞得以有效利用废水中的氮元素而快速生长。

表2鸡场废水中的非金属污染物含量

Table2 The content of nonmetallic pollutants in chicken farm wastewater

项目Item浓度/mg·L-1ConcentrationTN636±10.1TP121.76±5.7COD4 200±340

表3鸡场废水中的金属元素含量

Table3 The content of metallic elements in chicken farm wastewater

项目Item浓度/mg·L-1ConcentrationCr4.37±0.85K3.67±1.21Cu2.31±0.37Na1.89±0.32Ca1.55±0.29Mg1.05±0.49Zn1.02±0.41Fe0.31±0.15

图1 埃氏小球藻在不同浓度废水中的生长曲线Fig.1 The growth curves of Chlorella emersonii in different concentration of chicken farm wastewater

2.3 埃氏小球藻对鸡场废水中总氮总磷的去除效果

2.3.1 培养终期废水中的总氮残余量

总氮是衡量养鸡废水污染程度的重要指标，过量的氮可导致水体富营养化、酸化等[12]。对不同浓度鸡场废水中总氮的残留量连续测试显示，微藻能有效去除废水中的总氮。由图2可知，即使在生长条件最差的鸡场废水原液中，埃氏小球藻仍能去除部分氮，其氮含量从636 mg·L-1下降到457 mg·L-1。随着废水稀释度的增大，微藻脱氮的效果进一步显现。用稀释4倍、6倍和8倍的鸡场废水培养微藻，废水中总氮含量分别从172 mg·L-1、119 mg·L-1和77 mg·L-1下降到49.1 mg·L-1、26.9 mg·L-1和15.1 mg·L-1。微藻对不同稀释倍数废水中总氮去除率，差异显著(P<0.05)。

图2 不同稀释倍数鸡场废水中总氮含量的变化Fig.2 The change of total nitrogen content in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.3.2 培养终期废水中的总磷残余量

总磷含量是废水中的另一个重要污染指标。从图3可知，培养7 d后，废水中总磷含量显著下降。与废水中TN去除效果不同，废水原液和2倍稀释废水的TP去除效果显著，TP分别从起初的121.76 mg·L-1和62 mg·L-1分别减少到41.6 mg·L-1和18.94 mg·L-1(P< 0.05)。这可能是因为微藻对磷酸盐的吸收利用能力较强，磷酸盐主要用于ATP合成通路，并且多余的磷在胞内可以多聚磷的形式储存[13]。低稀释倍数废水中的氨氮含量过高，对微藻生长起到了抑制作用，导致微藻无法较高效率的吸收利用氨氮。

图3 不同稀释倍数下的总磷含量变化Fig.3 The change of total phosphorus content in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.3.3 埃氏小球藻对不同浓度鸡场废水氮磷的去除率

图4为微藻对不同浓度废水中TN和TP的去除率。微藻对高稀释倍数(稀释倍数>4)废水中N的净化能力高，以8倍稀释废水的净化效果最佳。微藻对原液废水和不同稀释倍数废水的除磷效率均较高，各处理间的TP去除率相差不大。

图4 埃氏小球藻对不同稀释倍数鸡场废水中TN和TP的去除率Fig.4 TN and TP removal rates by Chlorella emersonii in different dilution ratio of chicken farm wastewater

2.4 不同稀释度鸡场废水培养下埃氏小球藻总油脂含量

2.4.1 埃氏小球藻在不同浓度废水下的油脂积累量

对不同稀释度鸡场废水培养条件下微藻细胞油脂含量测试(图5)表明，废水中N含量越低，埃氏小球藻细胞积累油脂越高。BG-11培养基中氮含量为1.5 g·L-1，高于本研究所用鸡场废水原液中的氮含量。已有研究证实，微藻油脂积累量随着氮含量的降低而升高，在限氮条件下，微藻油脂含量可显著增加[14]。本研究中，不同稀释倍数废水中氮含量不同。在培养7 d后，8倍稀释废水的氮含量可从77 mg·L-1下降到15 mg·L-1，满足限氮条件。因此，如图5所示，微藻的总油脂含量随着废水稀释倍数的增加而增加，最高含油量可达34.6%，而BG-11培养基中的油脂含量仅为24.7%。

图5 不同稀释倍数废水培养下埃氏小球藻的油脂含量Fig.5 The oil content of Chlorella emersonii cultured in different dilution ratios of chicken farm wastewater

2.4.2 微藻细胞积累油脂的尼罗红荧光染色确认

尼罗红是一种亲脂性的荧光染料。与脂类物质以及各种脂肪酸结合后，在激发波长543 nm的激发下，显示强烈桔色荧光[15]。由图6可以看出，在BG-11培养基、0倍和2倍稀释废水中，藻细胞内很少或几乎观察不到橘黄色亮点(油滴)，而在高稀释倍数废水中的微藻细胞油滴较大，密集分布，呈现出强烈的橘黄色荧光，油滴数量和亮度随着稀释倍数的增大而增加，这说明高稀释倍数的废水中满足微藻高效产油的限氮条件。

图6 尼罗红荧光染色示埃氏小球藻胞内油脂Fig.6 The Nile red fluorescent staining showed the intracellular oil body in Chlorella emersonii

3 讨论与结论

现今集约化畜禽养殖业对生态环境造成了严重的污染，治理废水的任务十分艰巨。微藻处理畜禽养殖废水是一个可行的方案。畜禽废水的特点主要是氮磷重金属、固体悬浮物及化学需氧量含量高[16]。因此，针对其污染组分的特点，选择合适的微藻进行处理十分重要。但是，大多数畜禽废水存在氨氮含量过高、固体悬浮物过多的情况，导致许多微藻无法直接在其原液中生存。例如，Gonzalez等[17]利用藻菌系统处理猪场废水，发现微藻无法在原液及2倍稀释废水中生长，推测可能是高pH值和氨氮浓度抑制了微藻的生长。程海翔等[18]将栅藻Desmodesmussp.CHX1 接种于原液和高稀释倍数的养猪废水中，发现在高稀释倍数的废水中，微藻可快速生长，未出现抑制效应，而微藻在原液中第6天才开始缓慢生长。以上研究结果均与本研究结果相似，即在高稀释倍数的畜禽养殖废水中，埃氏小球藻可快速生长，生物量达2.51 × 106cells·mL-1,然而，未稀释和低稀释倍数的废水对微藻有明显的抑制效应。由此可见，对大多数畜禽废水进行稀释等预处理，有利于微藻迅速生长，达到脱氮除磷、获得生物质的目的。

在本研究中，埃氏小球藻对TN和TP的去除率最高可以达到80%及75%，这与前人的研究结果相似[19]。但是，最高去除率发生于稀释倍数较高的处理，即8倍稀释的鸡场废水中。在实际的生产应用中，应当兼顾效率与成本，使用大量的水去对废水进行稀释，不能满足绿色节约的理念。稀释倍数为4的废水养殖微藻，TN和TP去除率为71.45%和64.6%，可通过延长培养时间来提高清除率。相对于高稀释倍数废水而言，显然这是一种节约水资源的处理方式。进一步应深入研究微藻去除废水污染物的机理以及微藻净化畜禽废水优化实施方案。

总之，本研究表明，埃氏小球藻能有效去除鸡场废水中氮磷，特别是在废水稀释的情况下，效果更显著，且微藻细胞能高水平积累油脂。这为在实际的生产应用中建立兼顾水资源节约、环保、高效净化畜禽废水工程以及联产生物燃油优化工艺提供了科学参考。