尚欣春，沙芮，钱滢文，洪霞

（1.甘肃省商业科技研究所，兰州 730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，兰州 730010）

0 引 言

黄曲霉毒素M1属于黄曲霉毒素(Aflatoxins)一类结构相似的化合物中的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌(Asperillus Flavus)和寄生曲霉菌(Asperillus Parasiticus)产生的代谢产物,可以由黄曲霉毒素B1在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，生成AFM 1，也可由一些黄曲霉菌和寄生曲霉直接产生[1]。AFM 1的呋喃环环氧结构与体内DNA嘌呤残基共价结合,从而造成DNA的某些损伤，引起DNA结构和功能的改变，产生癌变。由于缺乏行之有效的防治和去毒方法,因此针对食品特别是乳制品，制定严格的AFM 1限量标准就尤为重要，中国对婴儿乳品中AFM 1的限量标准为不得检出，及牛乳中0.5μg/kg。限量标准的实施必须建立灵敏、准确、快捷的检测方法，自发现牛奶中含有AFM 1以来，对AFM 1的检测方法各国科学家做了大量的研究[2]，取得了很大的进展，现分类介绍如下。

薄层色谱法(TLC)样品经提取、浓缩、薄层分离后,AFM 1在波长的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。TLC操作复杂，AFM 1标准品浓度较高，潜在的污染性较高，特异性较差，灵敏度也相对较差，检测耗时长，检出限量为0.3μg，样品回收率为67%(鲜奶)，和80%(奶粉)，不适合大批量样品检测[3-4]。需提取净化的分析方法样品前处理操作烦琐，复杂，费时，劳动强度大。ELISA法相比而言，操作简便，快捷，污染较小，灵敏度也较高，适合批量样品的普检和筛选，但存在假阳性和假阴性的可能，且只能半定量[5]。高效液相色谱法（HPLC）自动化程度高，稳定性好，灵敏度高，但样品前处理中一般采用免疫亲和柱、C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱等。均有不同特点，免疫亲和柱特异性好，但成本高，操作繁琐[6-8]；C18柱操作要求高，且目标物容易残留在柱体内，影响回收率；以二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物为代表的聚合物基质SPE填料（HLB）自出现以来就备受分析者的青睐。这种吸附剂是由亲脂性的二乙烯苯和亲水性的N－乙烯吡咯烷酮按照一定比例共聚而成，同时具有反相吸附及正相保留的特征，因此适用于极性及非极性化合物的分析。同时，因为苯环和N－乙烯吡咯烷酮官能团作为该填料的骨架结构存在，不会因干枯而发生团聚，因此在实际使用过程中，既可以免去活化步骤，又可以不用担心柱床干枯造成回收率下降。其柱回收率，稳定性都很良好。虽然亲水亲脂共聚物微球在检测中应用较多，但使用方法均为滴加式的萃取柱，上样、淋洗、洗脱时液体只能缓慢滴落，一般固相萃取时间为20～30 min[9]。而如何以共聚物微球为固相载体，在其表面进一步修饰其他特殊物质，加速其萃取速度同样值得探索[10-15]。

离子液体是一种结构及性质可塑性很强的室温熔融盐，在合成催化，分离萃取，电化学等方面应用很广[16-17]。其中咪唑类离子液体对具有共轭结构的物质有良好的吸附特性。而将离子液体作为涂层，涂覆在二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物固相载体表面形成固载化离子液体，同样能显现出不同性质[18-19]。如何在此基础上探索对乳制品中AFM 1具有快速、高效、稳定吸附的新型固相萃取填料，尚未有报道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

N-甲基咪唑，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司；1-氯正辛烷，优级纯，上海麦克林生化科技有限公司；六氟磷酸钾，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司；AFM 1标准品，标准品（97.5%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；聚乙烯醇，分析纯（500 U/mL），阿拉丁试剂上海有限公司；N－乙烯吡咯烷酮，色谱纯，北京百灵威科技有限公司；二乙烯苯，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司；偶氮二异丁腈，分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司；柱层析用200-300目硅胶，分析纯，天津光复科技发展有限公司；中性氧化铝，分析纯，天津光复科技发展有限公司；大孔树脂，分析纯，天津光复科技发展有限公司；弗罗里硅土，分析纯，天津光复科技发展有限公司；C18固相萃取填料，分析纯，天津光复科技发展有限公司；牛奶阴性样品，兰州庄园乳业有限责任公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪，岛津20A，配荧光检测器，岛津科技有限公司；旋转蒸发仪，RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；离心机，RX-II型，天美中国科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 离子液体合成

根据文献[16]修改如下：1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐的合成（[C8MIM]Cl）：称取0.25 mol（20.53 g）N-甲基咪唑和0.258 mol（23.88 g）1-氯正辛烷于100 mL烧瓶中，加热回流24 h，用热乙酸乙酯多次洗涤反应后的液体，弃去乙酸乙酯，70℃旋转蒸发，得到淡黄色粘稠液体，备用；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的合成（[C8MIM][PF6]）：称取1-辛基-3-甲基咪唑氯化盐35 g溶于150 mL蒸馏水中，加入六氟磷酸钾48 g，搅拌0.5 h，分为两层，弃去上层后，用蒸馏水反复洗涤除去氯离子，在洗涤过离子液体的水中滴加0.1 mol/L的硝酸银溶液，直到不产生白色沉淀，证明氯离子洗涤干净。70℃旋转蒸发去除水分，得到淡黄色黏稠液体。将该液体溶于200 mL色谱纯甲醇中，加入10 g活性炭脱色。取上清液过大孔树脂固相萃取柱，接收全部流出液，70℃旋转蒸发去除多余溶剂。得到无色透明黏稠液体，备用。

1.3.2 固相载体二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球合成

根据文献[11]修改如下：向250份三口烧瓶中加入75 mL蒸馏水和1 g聚乙烯醇粉末充分搅拌溶解作为分散相备用。精密量取15 mL甲苯5 mL正辛烷9 gN－乙烯吡咯烷酮和15 g二乙烯苯至小烧杯中加入0.15 g偶氮二异丁腈混匀后倒入三口烧瓶中快速搅拌30 min加热至80℃冷凝回流，1 500 r/min搅拌反应12 h后停止反应，用水和甲醇清洗产物，于80℃下真空干燥4 h得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，该共聚物微球粒径大小为30～50μm。

1.3.3 离子液体固载化

秤取干燥的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球10 g，加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液体4 g，甲醇15 mL，超声处理30 min。于60℃下真空干燥2 h得到固相萃取填料。

1.3.4 该填料固相萃取柱装填

称取400 mg固相萃取填料于注射式固相萃取套管中，压实填料，加盖玻璃纤维垫片，给套管加盖。得到AFM 1注射式超快速固相萃取柱。如图1所示。

图1 AFM1注射式超快速固相萃取柱

1.3.5 试剂准备

105 g/L亚铁氰化钾水溶液，220 g/L乙酸锌3%乙酸水溶液，1 mol/L p H 7.0乙酸铵缓冲液。

1.3.6 样品前处理方法

称取发酵乳及固体乳粉、乳酪样品5 g，加30 mL水加热溶解；液态乳样品直接称取35 g，在样品液中加入5 mL亚铁氰化钾溶液，5 mL乙酸锌溶液，充分摇匀后再加入5 mL缓冲盐溶液，于5 000 r/min离心3 min。得到沉淀和上清液，上清液待净化富集。

1.3.7 固相萃取过程及检测方法

图2 AFM1标准及样品色谱图

取自制固相萃取柱，用注射器向萃取柱中加入得到的所有样品上清液，弃去流出液。控制萃取速度小于15 mL/min，即单个样品上清液全部流出所需时间为2 min。上清液全部留出后，用注射器加入5 mL蒸馏水淋洗，弃去流出液，并通过10 mL空气，将萃取柱中残留水吹出。用注射器加入2 mL甲醇，并通过5 mL空气，吹出萃取柱中液体，收集所有流出液，将流出液定容至2.00 mL。过0.45μm滤膜。进行高效液相色谱仪测定。色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：水+乙腈（v）=60+40；流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；激发波长：365 nm，发射波长：425 nm。得到标准色谱图和样品色谱图，如图2所示。

2 结果与讨论

2.1 离子液体对AFM 1吸附pH条件

分别用0.5 mol/L p H值为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的乙酸铵缓冲液，配制0.1 μg/mL的AFM 1标准溶液，按1.3.7方法处理上述11中溶液，进入液相色谱仪测定。结果如图3所示。

由图3可知，当样品液p H＜6时，酸性渐强，AFM 1容易与H+结合生成正离子盐，吸附能力减弱；当p H＞8时，碱性渐强，AFM 1容易生成负离子盐，吸附能力减弱。该填料对正负离子盐类吸附效果不佳，仅对有共轭结构的AFM 1有良好吸附。所以在样品前处理步骤加入pH 7.0的缓冲溶液。

图3 固相萃取柱对不同pH样品处理液的吸附效果

2.2 填料中离子液体与固相载体比例及萃取速度对吸附效果的影响

按1.3.3方法，制作离子液体与固相载体质量比分别为 0∶10，0.5∶10，1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，7∶10，10∶10，20∶10，的固相萃取填料，并制作固相萃取柱，使用上述固相萃取柱，按照1.3.6和1.3.7方法选择不同萃取速度处理50 ng/g的加标纯牛奶阴性样品，所测得结果如表1所示。选择检测结果最接近50 ng/g，且消耗时间最短，试剂最少的条件为最优条件。

由表1可知，仅使用固相载体，不固载离子液体时，虽然固相载体对AFM 1有一定的吸附效果，且随过柱时间的增加吸附效果增加，但是增加的效果不够理想，所以单纯使用二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球吸附AFM 1，样品前处理耗时过长。随着离子液体比例增加，固相萃取柱对目标物的吸附效果也明显增加，当比例达到4∶10的时候，继续增加离子液体比例，吸附效果增加缓慢，反而会增加检测成本，所以综合考虑选择最佳条件为，离子液体与固相载体比例为4∶10，30 mL样液过柱时间为2 min。

2.3 固相萃取柱中填料用量对吸附效果的影响

分别称取 100 mg，200 mg，300 mg，400 mg，500 mg，600 mg，700 mg，800 mg，1000 mg固相萃取填料，按1.3.4方法制作含有不同质量填料的固相萃取小柱，按照1.3.6和1.3.7方法处理50 ng/g的加标纯牛奶阴性样品，所测得结果如图4所示。

由图4可知，当填料质量＜400 mg时由于样品液需要快速过柱，填料过少不能有效的吸附目标物；当400 mg≤填料质量≤600 mg时，填料具有良好吸附；当600 mg＜填料质量时，由于填料过多，在洗脱步骤，2 mL洗脱液不能将所有目标物洗脱，所以检测结果会偏低。考虑检测成本，选择每只固相萃取柱含有400 mg填料。

表1 不同离子液体与载体比例及不同萃取速度对萃取效果的影响 ng/g

图4 填料质量对萃取效果影响

2.4 多种固相载体对比

选用硅胶，中性氧化铝，大孔树脂，弗罗里硅土，C18固相萃取填料及本实验合成的共聚物微球分别作为固相载体，按1.3.3方法制作离子液体固载化填料及固相萃取柱。按照1.3.6和1.3.7方法处理50ng/g的加标纯牛奶样品，所测得结果及样品液经过固相萃取柱时的现象如表2所示。

表2 不同材料作为离子液体的固相载体及其萃取效果

由表2可知，硅胶、中性氧化铝、弗罗里硅土为载体制作的固相萃取柱在萃取样液时均流出乳白色液体悬浊液，待悬浊液分层后，下层为少量离子液体。说明这三种载体与离子液体之间作用力很微弱，外力作用下离子液体很容易从载体上脱落，导致吸附能力差，检测结果偏低。大孔树脂为载体的固相萃取柱在萃取样液时均流出清澈液体，但上样时阻力很小，观察发现同样400 mg大孔树脂-离子液体填料比其他填料体积大，说明该填料非常松散，无法将目标物完全萃取。C18填料为载体的固相萃取柱在萃取样液时均流出清澈液体，但上样时阻力很大，因为水溶液与C18填料兼容性很差，不利于萃取进行。而亲水-亲脂的共聚物微球-离子液体填料，既满足载体与离子液体之间的作用力很牢固，同时满足与上样液兼容性良好。

2.5 固相萃取柱最大吸附上限

按1.3.3方法制作固相萃取柱。用p H为7的乙酸铵缓冲液分别配制含有AFM 1含量为100 ng，200 ng，500 ng，1 000 ng，2 000 ng，4 000 ng，5 000 ng，5 500 ng，6 000 ng，7 000 ng，8000 ng的溶液30 mL。按照1.3.6和1.3.7方法处理上述溶液，所测得结果如图5所示。

图5 一定质量的填料可有效吸附黄曲霉毒素M1最大质量

由图5可知，当样液中AFM 1含量≤5 000 ng时，400 mg容量的固相萃取柱能快速、稳定、高效的萃取其中目标物。国家标准限量远远小于5 000 ng，所以该固相萃取柱的柱容量也完全满足正常检测需要。

2.6 方法加标回收率及方法稳定性实验

按照1.3.6和1.3.7方法处理三个加标水平的纯牛奶阳性样品，每个样品6平行，回收率及RSD值结果图表3所示。

由表3可知，该方法回收率为90.1%～92.7%，RSD%≤2%，证明该方法结果稳定，满足检测要求。

2.7 方法线性范围、线性方程、检出限参数

以线性范围评价该方法的检测浓度范围，当3倍信噪比对应的浓度为仪器检出限，以最低检出限评价该方法灵敏度，结果见表4。

由表4可知，该方法线性良好。方法采用浓缩的方式处理样品，固体乳样品浓缩2.5倍，液体乳样品浓缩17.5倍，所以固体乳样品方法检出限为0.4 ng/g，液体乳样品方法检出限为0.06 ng/g。该方法灵敏度高，适合AFM 1的痕量检测。

表3 黄曲霉毒素M1 3个加标水平，实际样品回收率及RSD值实验结果

表4 标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限

2.8 方法实际应用

在市场及超市随机抽取50份样品，其中纯牛奶20份，酸奶10份，乳饮料10份，奶糖4份，奶油3份，奶酪3份。按照1.3.6和1.3.7方法处理，并检测其中AFM 1含量。50份样品中仅有一份纯牛奶样品出现涨袋现象，且样品有沉淀出现，该样品AFM 1含量为1.53 ng/g。其余样品均未检出含有AFM 1。

3 结 论

提出超快速固相萃取的想法，固相萃取过程仅需2 min。并结合亲水亲脂共聚物微球-离子液体涂层，形成复合固相萃取填料在pH为6～8时，对乳及乳制品样品处理液中AFM 1吸附能力强，吸附速度快，吸附效果稳定。整个试验操作简便快捷。克服了常规液相色谱法中操作繁琐，萃取柱高成本，前处理耗时长的缺点。同时该方法回收率、精密度良好，准确度高，重显性好，在实际样品中应用良好。为超快速固相萃取及AFM 1检测方法提供参考。