蒋孟圆，刘晓松，胡琳，马晓年，欧利华，张秀清，李文廷*

(1.云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室, 昆明 650500；2.昆明市疾病预防控制中心, 昆明 650228)

花椒为芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL.)植物, 既是一种常用的食品调味料，被誉为“八大调味品”之一，又是一味传统中药[1]，含有多种对人体有益的活性成分，具有抑菌[2]、麻醉和兴奋[3]、抑制血小板凝集、抗氧化等多种作用[4]，有较好的临床应用价值和研发潜力[5-7]。《本草纲目》记载花椒具有“散寒除湿、解郁结、消宿食、通三焦、温脾胃、补右肾命门、杀蛔虫、止泄泻”的作用[8]。《中华人民共和国药典》记载花椒具有“温中止痛, 杀虫止痒”的作用。花椒对炭疽杆菌等10 种革兰氏阳性菌以及大肠杆菌等肠内致病菌均有明显的抑制作用,在油脂中加入定量的花椒油对人体具有一定的保健作用, 对食品也起到一定的防腐抗菌作用[9]，从而可提高产品的储藏效果[10,11]。

真菌毒素是由真菌产生的具有毒性的次生代谢物[12]，可引起动物急性、亚急性和慢性中毒，其中某些真菌毒素具有致畸、致癌、致突变特性的严重影响[13]，其在食品中的污染问题，已经成为世界各国及有关国际组织关注的重点[14]。目前, 国内外对花椒的化学成分[15,16]、药理作用以及提取工艺有较深入的研究，而对其稳定性的研究甚少，由于花椒及其油检测标准的不合理性，导致了重金属、农药残留和黄曲霉毒素等项目的监测不足[17]。在抑菌活性测试中，花椒油在4 μL/mL时仍有桔青霉菌生长[18]，花椒中黑曲霉的检出率达到40%[19]，花椒在收获、加工以及储运过程中容易受到多种真菌以及真菌毒素的污染，在日常生活中，自制花椒油中也经常会出现霉变现象。为此，本研究主要对花椒油在存储及食用过程中是否产生真菌毒素进行研究分析。

近年来，在谷物、蔬菜、水果、畜牧产品以及中药材中均发现了真菌毒素的存在。检测真菌毒素的方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、气相色谱法、免疫亲和柱净化高效液相色谱法，均检测单一类的真菌毒素[20-23]。液相色谱-串联质谱法具有较高的灵敏度和较好的准确度，逐渐成为同时检测多种真菌毒素的主要方法，本研究将样品前处理方法便捷化，通过脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素内标物的内标法和各真菌毒素的外标法结合定量，采取负离子扫描模式，建立超高效液相色谱-串联质谱法同时检测自制花椒油中11种真菌毒素的分析方法，为花椒油的健康食用提供安全保障。

1 材料与方法

1.1 仪器

1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪 美国Agilent Technologies公司；串联QTRAP 4500质谱联用仪(配有电喷雾离子源) 美国AB SCIEX公司；XS205DU 型分析天平(十万分之一) 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Arium Pro D1纯水处理终端机 德国Sartorius公司；Pribofast M226 多功能净化柱 美国Pribolab公司；3H16RI型智能台式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 试剂

11种标准品: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)、伏马毒素B1(FB1)、伏马毒素B2(FB2)、伏马毒素B3(FB3)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及13C-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素：均购自美国Pribolab公司; 质控样：购自美国Romer Labs Diagnostic GmbH公司; 甲醇、乙腈：均购自美国Sigma-Aldrich 公司;实验中所用水为去离子水。

1.3 实验材料

花椒油样品：均为日常生活中食用的自制花椒油。花椒油的做法：将购自农贸市场的新鲜或干燥的花椒直接放入70 ℃的植物油内浸泡放置，食用时间最长的花椒油样品为24个月。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液的配制

用甲醇分别将11种真菌毒素的单一标准溶液稀释为1 μg/mL的混合标准储备液,13C-ADON稀释为250 μg/L的标准储备液, 依据11种真菌毒素在质谱MRM模式下响应程度的不同, 将其配制成不同浓度的混标溶液, 使用时用流动相的初始比例溶液配制系列标准工作液, 每个标准工作液中均含有20 μL13C-ADON的内标物质。

1.4.2 样品溶液的制备

精确称取花椒油样品5.0 g,置于50 mL具塞样品管中,加15 mL 70%甲醇水溶液,超声提取1 h,离心5 min (10000 r/min),取5 mL上清液通过M226多功能净化柱净化。准确量取2 mL净化后的溶液,用氮吹仪浓缩近干,用流动相初始比例溶液溶解并定容至1 mL,经0.22 μm微孔滤膜过滤,供仪器备用。

1.4.3 液相色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),柱温为40 ℃,流动相为乙腈(A)+0.2%氨水溶液(B),流速为0.3 mL/min，进样体积为5 μL,检测分析时间为6.0 min。

1.4.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，温度: 550 ℃；离子喷雾电压(ionspray voltage)：-4500.0 V；气帘气(curtain gas):25 psi；雾化气(gas 1)：55 psi；辅助气(gas 2)：55 psi；负离子扫描模式；多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行检测。将分别配制成250 μg/L的12种真菌毒素甲醇溶液在流动注射状态下，通过Q1 MS全扫描模式得到各真菌毒素的母离子(M1-)m/z，Product Ion Scan(MS2)碎片离子扫描模式得到次级碎片离子信息,采取峰值较高的2个碎片离子作为定量离子和定性离子,对质谱中与检测化合物相关的参数通过MRM扫描模式进行优化，详细参数见表1。

表1 12种真菌毒素的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters for 12 kinds of mycotoxins

续 表

注：“*”为定量离子。

2 结果与分析

2.1 流动相种类和比例的选择

本研究考察了流动相分别为乙腈-水、甲醇-水、甲醇-氨水和乙腈-氨水的实验, 实验结果表明：以乙腈(A)-0.2%氨水(B)作为流动相进行梯度洗脱，具有较高的质谱信号响应, 峰形对称，结果较为理想，梯度洗脱程序为:0～0.5 min，95% B～70% B;0.5～3.0 min，70% B～40% B; 3.0～3.5 min，40% B～5% B; 3.5～4.5 min，5% B; 4.5～5.0 min，5% B～80% B; 6.0 min，95% B。依据最佳优化实验条件下得到11种真菌毒素的MRM色谱图，总离子图见图1，其余各真菌毒素的碎片离子图见图2。

图1 11种真菌毒素的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

图2 11种真菌毒素的碎片离子MRM色谱图Fig.2 MRM fragment ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察

依据在质谱MRM模式下响应程度的不同，将11种真菌毒素标准物质配制为不同浓度范围的混合标准溶液，以定量离子峰的峰面积为纵坐标，以质量浓度(μg/L)为横坐标绘制标准曲线,线性参数见表2。

表2 11种真菌毒素的线性参数、检出限及定量限Table 2 Linear parameters, limit of detections and limit of quantifications of 11 kinds of mycotoxins

2.2.2 检出限及定量限

将真菌毒素混合溶液最低浓度点稀释进行测定, 以3倍信噪比(S/N)对应的浓度计算检出限(limit of detection, LOD)，10倍信噪比对应的浓度计算定量限(limit of quantity, LOQ)，具体实验数据见表2。

2.2.3 加标回收率及精密度实验

称取18份5.0 g花椒油样品，添加低、中、高3个质量浓度1.0，2.0，5.0 μg/kg的混合标准溶液进行加标回收实验，每个浓度进行6个水平测定，按照1.4.2前处理条件进行处理并测定，并计算相对标准偏差，考察方法的精密度，11种真菌毒素的回收率为68.5%～102.5%，相对标准偏差为0.81%～6.87%，具体结果见表3。

表3 真菌毒素的加标回收率(n=6)Table 3 Recoveries of mycotoxins (n=6) %

2.2.4 稳定性实验

分别进样5 μL放置0，5，10，24，48 h后的混合标准溶液,由峰面积计算相对标准偏差, 黄曲霉毒素B1为0.79%，黄曲霉毒素B2为0.68%，黄曲霉毒素G1为0.74%，黄曲霉毒素G2为0.81%，玉米赤霉烯酮为1.76%，脱氧雪腐镰刀菌烯醇为1.89%，3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇为2.21%，15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇为2.34%，伏马毒素B1为3.57%，伏马毒素B2为3.64%，伏马毒素B3为4.21%，实验数据表明各真菌毒素在48 h内处于稳定状态。

2.2.5 准确度实验

准确称取5.0 g不同浓度的真菌毒素质控样各3份，按照1.4.2前处理条件进行处理质控样品，各真菌毒素的检测值均在参考值允许范围内，实验数据表明样品提取效率较高，实验准确度良好，具体数据见表4。

表4 准确度数据Table 4 Accuracy data μg/kg

2.3 讨论

2.3.1 提取液的选择

本研究选择甲醇、乙腈以及两者的不同浓度水溶液作为提取液，通过标准溶液以及加标回收率的检测实验分析，结果表明使用70%的甲醇水具有较高的提取率，检测结果较为理想。

2.3.2 基质效应的影响

采用甲醇溶液配制标准工作液以及采用花椒油样品作为基质配制标准溶液，通过样品处理后进行11种真菌毒素的检测分析，实验表明花椒油的基质效应对11种真菌毒素的检测没有较大影响。

2.3.3 样品的净化

本研究进行多功能净化柱和0.22 μm滤头直接过滤的净化对比实验，实验结果表明：2种净化实验数据并无较大差别，信噪比结果一致，加标回收率结果没有较大差异。对花椒油中11种真菌毒素的检测可以选择0.22 μm滤头进行净化操作，从而提高样品的检测效率，降低经济成本。

3 结论

通过对食用不同时长的花椒油样品进行实验分析，均未检测出11种真菌毒素，实验数据表明：日常食用的自制花椒油在短期储存内不易滋长已知的真菌毒素，在花椒油中浸泡的花椒虽然出现了白色的霉菌，但亦未检出11种真菌毒素。花椒油虽然有抑菌作用，也未检出常见的真菌毒素，但仍然会有其他细菌及真菌毒素如黑曲霉素的产生，因此为了食用的健康安全，要做好花椒油的存储工作，出现霉变现象最好不要继续食用。超高效液相色谱-串联质谱法测定11种真菌毒素的方法具有较好的加标回收率，较高的准确度，前处理便捷，适用于花椒油中多种真菌毒素的快速检测。