孙成群 任应清 程 坚 张炯华 王茉莉 袁乐丽

骨折是指骨结构的连续性发生部分或完全断裂，多发于儿童和老年人，但目前由于各方面的原因，骨折发生的数量显著增加。骨折的愈合从生理、组织及生化角度可以划分为5个阶段：诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和重建期，5个阶段互为重叠［1］，其愈合过程是相当繁杂的，过程受到多种激素及因子的影响，如骨基质中大量存在的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），在人体内其表达量是酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）的10倍。在人体内bFGF可以促进骨折早期的软骨修复，同时具有促进血管增殖的作用。有研究也报道局部或全身应用bFGF可以加速骨和软骨的形成，缩短骨折愈合时间［2］。而骨折发生时常伴随周围组织及血管的破坏，导致骨折断端出现血流障碍，造成愈合过程缓慢，其中血管内皮生长因子（VEGF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有诱导血管新生的作用［3］。虽然目前临床上治疗骨折的方法较多，但骨折愈合过程中内固定、生长因子及血流量的供给仍然是关键的不可或缺因素，因此，本文主要从生长因子及血流量的供给来深入探究bFGF对骨折愈合过程中VEGF表达的影响及二者在促进骨折愈合中的作用。

1 临床资料

1.1 材料 动物：健康雄性SD大鼠共40只，体重240～270g。药品及试剂：10%水合氯醛（行知生物科技有限公司），生理盐水（西安悦来医药科技有限公司），bFGF（武汉禾元生物科技有限公司），戊巴比妥（上海西陇化工有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京索莱宝科技有限公司），10%乙二胺四乙酸钠（河北诚信有限责任公司），无水酒精（广东中能酒精有限公司），VEGF多克隆抗体试剂盒（上海抚生实业有限公司），苏木紫-伊红染色试剂（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），DAB（Diaminobenzidine）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），SABC（strept avidin-biotin complex）免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）试剂盒购自武汉优尔生科技有限公司。仪器：注射器（江苏正康医疗器械有限公司），克氏针（深圳佰慕斯精密科技有限公司），电子天平（FA2004A型号，上海精天），低温冰箱（三洋公司，日本），石蜡切片机、石蜡包埋机（沈阳誊德电子仪器有限公司），生物显微镜、光学显微镜（日本）；离心机（80-2型，上海），Mias-2000图像分析系统及MIPRD图像处理软件（南京天龙光电仪器厂）。

1.2 实验方法 （1）分组与造模［4］：按照随机数字表法将40只雄性SD大鼠随机均分为2组：对照组和观察组各20只大鼠，然后再分别将对照组、观察组按照造模后 7d（D7）、14d（D14）、21d（D21）、28d（D28）4个时间点随机均分，每个时间点5只大鼠。参照文献方法进行造模：所有大鼠均采用水合氯醛麻醉法麻醉（10%，0.25ml/100g），待麻醉满意后采用正规手术方法用线锯断胫骨，然后用合适直径的克氏针进行髓腔内固定，用生理盐水冲洗后缝合伤口，伤口无菌包扎。造模后立即对观察组（20只）所有大鼠的骨折断端注射bFGF（600μg/kg，注射1次/2d），对照组用同样的方法在大鼠骨折断端注射生理盐水。（2）取样：观察组及对照组分别在造模后D7、D14、D21、D28注射过量戊巴比妥处死5只大鼠，截取胚骨制作骨痂标本。将标本固定在4%多聚甲醛溶液中24h，然后流水冲洗12h，用10%的乙二胺四乙酸钠室温下脱钙21d，使用梯度酒精法脱水。用石蜡沿骨折方向纵向包埋后制作成5μm层厚的纵向组织切片。（3）组织学观察：将制作好的石蜡切片脱蜡脱水，苏木紫-伊红染色（HE）行脱水、封片后用显微镜观察。（4）免疫组织化学染色：将蜡块切成4μm厚的切片贴在载玻片上，常规脱蜡脱水后加入VEGF单克隆抗体（抗体稀释度为1：2000），SABC染色后用显微镜观察新生血管情况。（5）VEGF表达水平测定：首先将骨痂置入乳钵中，加生理盐水进行研磨，离心后取上层清液，将上层清液用蒸馏水稀释100倍制得标本溶液。滴加1ml蒸馏水置标准品溶液中（浓度为8000pg/ml），然后将其装在8个试管中，每个试管中再加入300μl稀释后的标本溶液，然后1号管中加入300μl浓度为8000pg/ml标准品溶液，然后从1号管中吸出300μl加入2号管，然后再从2号管中吸出300μl加入3号管，依次类推，其中7号管中吸出300μl废弃掉，8号管作为对照管。检测每管的光密度，从而计算出血管中VEGF的含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察 D7：对照组骨折断端有少量的成纤维细胞，成骨样细胞形成，但伴有明显的骨膜反应。观察组成骨样细胞量远大于对照组，肉芽组织大量形成，骨膜反应较轻。D14：对照组骨折间隙可见软骨内成骨现象。观察组中骨折间隙软骨内成骨明显，有较多成熟软骨细胞，并伴有新生管形成。D21：对照组骨折处成骨细胞增殖，软骨细胞呈肥大样，部分呈现钙化样。观察组骨折处出现较多成熟板层骨，伴有成熟的骨小梁生成即开始骨痂塑型期。D28：对照组骨折处出现部分成熟板层骨，观察组形成大量成熟板层骨，基本完成骨痂塑性。

2.2 免疫组织化学染色新生血管生成情况 （1）显微镜下观察：D7：对照组骨痂处几乎无着色的棕色细胞颗粒，观察组骨痂周围见棕色细胞，但两组均未见新生血管形成。D14：对照组骨痂处有少量着色的棕色细胞颗粒，观察组骨痂周围着色的棕色细胞由外向内逐渐减少，可见少量血管芽和血管腔形成。D21：对照组骨痂周围着色的棕色细胞由外向内逐渐减少，也可见少量血管芽和血管腔形成，观察组仅骨痂深处有棕色颗粒，并有大量血管芽、血管腔形成。D28：对照组骨痂仅有少量棕色细胞颗粒，小血管腔逐渐形成，观察组中血管腔扩大，血管数量大量增加。（2）新生血管计数结果：D7两组均未见新生血管形成。D14对照组新生血管量为0，观察组为（14.46±2.68），差异有统计学意义（P＜0.05）。D21对照组新生血管量为（12.63±2.21），观察组为（17.10±2.53），差异有统计学意义（P＜0.05）。D28对照组新生血管量为（28.39±4.52），观察组为（42.32±5.82），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 VEGF表达水平测定 术后D7、D14、D21、D28 4个时间段观察组VEGF表达量均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 术后两组各时间点VEGF表达量（pg/ml）

3 讨论

骨折愈合是一个极其复杂且缓慢的过程，期间受到多种因子及激素的调控，其中内固定、生长因子及血流量的供给仍是关键的不可或缺因素［5-6］。国内外大量的研究表明，生物因子在骨折愈合过程中起到了重要作用。多种动物骨折模型及兔的骨质延长术中多次使用局部注射bFGF［7-9］。有研究表明，大鼠全身注射bFGF可以刺激皮质骨 、松质骨的形成［10］。而本文主要是研究bFGF对骨折处VEGF合成的影响，主要深入探讨bFGF对VEGF表达影响。

本研究组织学观察结果显示，术后D14开始观察组中骨折间隙软骨内成骨明显，有较多成熟软骨细胞，并伴有新生管形成。免疫组化染色结果显示，术后D14开始观察组骨痂周围着色的棕色细胞由外向内逐渐减少，可见少量血管芽和血管腔形成，而对照组术后D21开始形成少量血管芽和血管腔。新生血管计数统计结果显示观察组D14开始出现新生血管，而对照组D21开始出现新生血管，比观察组延迟了7d，而且D14、D21、D28 3个阶段观察组新生血管量均显著高于对照组。术后D7、D14、D21、D28 4个时间段观察组VEGF表达量均高于对照组，且对照组VEGF定量水平峰值与观察组之间间隔7d。有研究表明bFGF内皮细胞强有力的有丝分裂原，体内体外均可促进血管生成［11］，当骨折处缺血时，bFGF分泌促进VEGF分泌，两者协同共同作用于骨折处，改善其缺血情况，促进骨折愈合过程。

综上所述，骨折处局部注射bFGF可以增加骨折愈合过程中VEGF表达量，并延长其表达时限，两者共同作用可以促进骨折愈合过程。