阚 默，石晓征，曲晓波

（长春中医药大学，长春 130117）

骨质疏松症是一种全身代谢性骨病，与骨质量下 降、成骨不足等原因有着密切的关联[1-3]。现代研究发现，TGF-β/Smad信号通路参与了成骨细胞的增殖、分化过程，影响了成骨细胞活性与功能，成为了现代治疗骨质疏松药物的研究热点[4]。在此信号通路转导的过程中，激活了转化生长因子-β（TGF-β）识别，活化了 Smad 2、 Smad 3蛋白[5-6]。Smad 2、Smad 3活化后与Smad 4形成异位复合物并进入细胞核内，开启了细胞内的信号反应级联传导，调节靶基因的转录，影响了成骨细胞增殖和分化，以及 I 型胶原蛋白的合成[7-8]。

鹿茸是我国珍稀名贵的动物药材，有“益精髓，强筋骨”之功效，并富含大量有助维持骨密度的胶原蛋白[9-11]。本课题组在此前的研究中成功从梅花鹿茸中提取了鹿茸I型胶原（SDC-I），同时发现了SDC-I可诱导骨髓基质干细胞成骨的分化[12-14]。MC3T3-E1 细胞是C57BL6 乳鼠源性的成骨细胞，常用于骨细胞的机理研究[15]。本实验在前期工作基础上，从MC3T3-E1细胞增殖和MC3T3-E1 细胞分泌的活性因子 TGF-β1、Smad2、Smad3 角度，对鹿茸I型胶原的作用机理进行了深度研究，旨为鹿茸I型胶原抗骨质疏松症的治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂与药品 成骨细胞株MC3T3-E1购自于中科院上海细胞库；SDC-I（相对分子质量 3.1 × 104，质量分数56.89%）由长春中医药大学分子药理实验室制备；Trizol（美国Invitrogen公司）；H-DMEM 培养基（美国 Gibco 公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（美国Sigma 公司）；青霉素、链霉素粉剂（华北制药股份有限公司）；DNA Maker，Bio Teke super RT Kit，2×SYBR Real-time PCR premixture Kit（北京百泰克公司）；溴化乙锭（EB），10×loading buffer（日本Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，北京鼎国公司）；引物由安徽通用生物系统有限公司合成；细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、TGF-β1、Smad2、Smad3 ELISA试剂盒（美国RND公司）。

1.2 仪器 CO2细胞培养箱（日本 SHELLAB）；生物洁净安全柜（苏净设备公司）； BT125D 型分析天平（德国 Sartorius 公司）；5430R型冷冻离心机、倒置 显 微 镜 （日 本 OLYMPUS CK40）；Mastercycler 型PCR仪（德国 Eppondorf 公司）；Min-Sub 型核酸电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；FHB100 型制冰机（上海比朗公司）；Omega Lum C 型凝胶成像仪（美国 Aplegen公司）；多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）。

2 方法

2.1 MC3T3-E1细胞培养 将 MC3T3-E1细胞放置于含有10%胎牛血清DMEM培养基中，青链素、链霉素各100 u/mL，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内常规培养，待细胞长至80%时进行实验。

2.2 分组及给药 实验分4组：空白对照组，只加培养液；SDC-I低剂量组（SDC-I-L），I 型胶原蛋白 0.2 mg/mL；SDC-I中剂量组（SDC-I-M），I 型胶原蛋白 0.4 mg/mL；SDC-I高剂量组（SDC-I-H），I 型胶原蛋白 0.6 mg/mL。

2.3 MC3T3-E1细胞活力测定 取传代3次，处于对数生长期的MC3T3-E1单细胞悬液，调整至细胞浓度为 5×104个 /mL，接种到96孔板中，100 μL/孔 ，每组设6个复孔，培养箱中孵育贴壁。分别加入不同浓度的SDC-I，继续培养24、48、72 h。每孔加MTT（5 mg/mL）10 µL后再次孵育4 h，弃去培养液，再加入DMSO溶液，150 µL/孔，振荡混匀10 min，让结晶溶解，通过多功能酶标仪在490 nm波长下检测各孔吸光度，最后确定最佳给药时间 。

2.4 TGF-β1/Smad信号通路相关基因表达的检测 应用RT-PCR方法检测TGF-β1 、Smad2、Smad3基因的表达水平。取传代3次，处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，用0.25%胰酶消化，将浓度为2×104个/mL细胞接种在24孔板中，待细胞贴壁后，进行分组给药，再连续培养48 h后进行实验。收集细胞，采用Trizol一步法提取 RNA。琼脂糖电泳检测总RNA，取适量RNA进行反转录实验，其余加入无水乙醇1 mL混匀，置于- 80 ℃保存。按照 Bio Teke super RT Kit 说明书配制反转录反应液。设置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反应结束后冰浴，4 ℃ 保存备用。待反应结束后，通过超微量紫外分光光度计检测反转录液中cDNA的浓度。按照2×SYBR RT-PCR premixture Kit 说明书配制反转录反应液。采用“三步法”进行RT-PCR 实验，设置反应程序： 95 ℃，起始模板预变性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s；3） 72 ℃ ，30 s，循环次数为 40。记录各组目的基因的融解曲线和扩增曲线。内参基因为β-actin，记录并分析各组目的基因的相对表达量，进行差异性比较。引物序列，见表1。2.5 TGF-β1/Smad信号通路中相关蛋白含量检测 用10 cm培养皿培养细胞（1×106个细胞），按照上述方法给药后，用1 mL的0.01 mol/L PBS洗3次；加入300 μL的RAPI蛋白裂解液，冰上裂解30 min；将裂解液转移到1.5 mL EP管中，12 000 r/min 4 ℃离心30 min，取上清。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度的测定。将各组细胞总蛋白放- 80 ℃冰箱保存。利用ELISA法检测TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表达，将各组成骨细胞总蛋白分别按TGF-β1、Smad2、Smad3酶联免疫试剂盒操作说明进行检测实验，通过多功能酶标仪测定各孔OD值。

表1 RT-PCR引物碱基序列

2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件进行数据处理，进行Student’s t检验分析，数据以均数±标准差（x± s ）表示，以 P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 SDC-I对MC3T3-E1细胞增殖率影响 各组细胞给予不同浓度的SDC-I，通过MTT法检测各组细胞的生长、增殖情况，见图1（插页二）。与空白对照组比较，SDC-I-L组、SDC-I-M组、SDC-I-H组均可以促进MC3T3-E1细胞增殖，同时在48 h细胞增殖作用最为明显（P＜0.05），所以选用SDC-I作用48 h后再进行实验。

3.2 各组MC3T3-E1细胞TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表达比较 见表 2。

3.3 各组MC3T3-E1细胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白含量比较 见表 3。

表2 各组 ME3T3-E1 细胞 TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表达比较（x± s ）

表3 各组ME3T3-E1细胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白含量比较（x± s ）

4 小结

鹿茸作为一种名贵中药，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任的功效，含有大量与骨形成相关的I 型胶原蛋白[16-17]。前期研究发现，SDC-I能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化。本研究发现， 经SDC-I干预后的成骨细胞中，TGF-β1基因以及其相关Smad2/3基因表达水平明显受到促进，当TGF-β1蛋白表达升高时，成骨细胞中的Smad2/3蛋白表达水平也明显提升，这表明了通过上调TGF-β1、Smad2以及Smad3基因蛋白的表达，可以促进成骨细胞中靶基因的表达，从而提高成骨细胞的分化，达到治疗骨质疏松症的目的。为进一步验证SDC-I治疗骨质疏松症等代谢性骨疾病提供了新的有力依据。