□ 于家丰 辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心

本文提供了液相色谱—串联质谱法（LC—MS）检测饲料原料中维生素A、维生素D3、维生素E的方法，该检测方法可以实现维生素A、维生素D3、维生素E的联检，且LC—MS方法灵敏度较高，比现行高效液相色谱法高1000倍以上。LC—MS方法可应用于饲料原料、粮食、农产品、食品等维生素A、维生素D3、维生素E含量很低的样品的检测。该方法在0.1～100IU/L的浓度范围呈现良好的线性关系，标准曲线R2＞0.999；维生素A、维生素D3、维生素E的回收率均达到80.0%～110%，相对偏差不大于15%。

现行的饲料中维生素A、维生素D3、维 生 素 E（ 以 下 简 称“VA、VD3、VE”）的检测方法均为液相色谱法，其中VA的检测方法为GB/T 17817-2010， 定 量 限 为 1000IU/kg；VD3检测方法为GB/T 17818-2010，定量限为500IU/kg；VE的检测方法为GB/T 17812-2008，定量限为1IU/kg。饲料原料中VA、VD3、VE含量在方法的定量限之下时，上述方法无法准确检出它们的含量。虽然饲料原料中VA、VD3、VE的含量很低，但由于饲料原料的添加比例很大，因此饲料中VA、VD3、VE的总量十分很可观，故研究适用于饲料中VA、VD3、VE低含量的检测方法是一件十分有价值的工作。

1 研究内容

1.1 优化前处理方法

1.1.1 皂化反应溶液需先离心：皂化反应后的样液转移至离心管中，离心取上清液转移至分液漏斗中，防止样品残渣堵塞分液漏斗。

1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因为石油醚的毒性低于乙醚，因此用石油醚代替乙醚。

1.2 考查线性相关性

用甲醇溶液配置VA、VD3、VE工作液，其系列浓度分别为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。相同条件下，用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积，VA的浓度与峰面积的相关系数为0.9998，VD3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999，VE的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。

1.3 净化小柱的选择

根据VA、VD3、VE的性质特点，应选取吸附特性为非极性的净化小柱。经查阅资料，选择安捷伦公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA 4种净化小柱。笔者分别考察并进行了VA、VD3、VE过净化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA净化小柱VA、VD3过柱回收率达到99%，VE过柱回收率达到93%。结果表明，Bond Elut PLEXA小柱可以实现饲料中VA、VD3、VE的净化。

1.4 洗脱液的选择

笔者分别考察了乙腈、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正己烷、甲基异丁酮的洗脱效果，回收率表明：用丙酮做洗脱液，VA、VD3过柱回收率达到100%，VE过柱回收率达到98%，因此选择丙酮做洗脱液。

1.5 净化程序

用3mL 80%甲醇水溶液活化小柱，适量样液上柱，再用3mL 80%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干，3mL丙酮洗脱，50℃氮气吹干，甲醇溶液复溶，过膜，供LC-MS检测。

1.6 仪器条件的确定

1.6.1 色谱条件的选择

本实验采用实验室常用的C18色谱柱，以甲醇、水作为流动相进行研究。由于 VA、VD3、VE中含有氮原子和氧原子，易于接受氢质子，因此质谱检测方式选用正离子模式。经实验比较发现，选用C18色谱柱（柱长100mm，内径2.1mm， 粒 径 2.4μm）、0.2%甲酸水溶液和甲醇作为流动相，得到的色谱峰对称性好，无拖尾现象，待测物与样品中的杂质分离效果理想。

液相色谱条件为，色谱柱：C18柱、柱长100mm、内径2.1mm、粒径2.4μm；流动相：A相为甲醇，B相为0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱（见表1）；柱温：40℃；进样量：10μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.6.2 质谱条件的选择

由于仪器厂家不同，质谱各参数也不一致，其参考条件如下。离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度；定性离子对、定量离子对等参数见表2。

表2 VA、VD3、VE的定性、定量离子对及碰撞能量参考值

表3 VA、VD3、VE的添加回收试验一览表

1.7 样品基质效应对回收率的影响

准确移取VA、VD3、VE标准溶液适量，分别加入6份空白样品中。经提取、净化及浓缩后，加甲醇溶液定容，充分混匀，制得浓度为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L的基质匹配标准工作液，现用现配。

1.8 饲料原料加标回收试验

选择典型的饲料原料，包括玉米面、米糠、小麦麸、棉粕，回收结果为80%～110%。回收试验表明，该方法定量检测对饲料原料均有较好的适用性（见表3）。

1.9 部分饲料原料检测结果

对米面、米糠、小麦麸、棉粕4种植物性饲料原料进行了检测。4种植物性饲料原料中维生素E的含量较高，其中，米糠的含量最高，达到了39.88IU/kg；小麦粉次之，达到了20.25IU/kg；棉粕的含量最低，为3.354IU/kg。4种植物性的饲料原料中VA、VD3均未检出，检测结果见表4。

表4 部分饲料原料的检测结果一览表

1.10 检出限与定量限

空白饲料中VA、VD3、VE添加浓度为0.5IU/kg,信噪比＞10，因此定量限确定为0.5IU/kg。空白饲料中VA、VD3、VE添加浓度为0.1IU/kg，信噪比＞3，因此检出限确定为0.1IU/kg。

2 讨论

2.1 饲料原料中维生素E的含量不能被忽略

农业部2625号公告给出配合饲料中VE推荐添加量。由表4可知，如果配合饲料中添加一定比例的米糠、小麦粉等饲料原料，饲料配方设计中外源性VE添加量为饲料配方设计的VE理论添加量减去饲料原料中VE含量，且外源性VE的添加量会一定程度地减少。在饲料生产实践过程中节约了VE的添加成本，提高了饲料加工生产效益。

表5 农业部2625号公告给出配合饲料中维生素E推荐添加量

2.2 皂化过程对VA、VD3、VE有一定的破坏作用，因此，要用经过皂化反应的VA、VD3、VE的对照品来定量。

2.3 要注意基质效应，饲料原料中VA、VD3、VE的检测是有一定的基质效应的，因此要充分考虑样品的基质效应，饲料原料基质效应见表6。

3 研究结果

维生素A的浓度与峰面积的相关系数为0.9998，维生素D3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999，维生素E的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。方法定量限为0.5IU/kg，方法检出限为0.1IU/kg。相对偏差小于20%。回收率在80%～110%。回收试验表明，该方法适合饲料原料中维生素A、维生素D3、维生素E的检测。

表6 饲料原料基质效应一览表