浙江中医药大学药学院药理研究所，浙江 杭州 311402

乳头皲裂(nipple trauma)作为哺乳期的常见病之一，在世界各地具有较高的发病率，处理不当时可以引起局部渗血、溃疡甚至导致乳痈。研究显示，由于乳头皲裂所引起的疼痛和焦虑通常会导致产妇放弃母乳喂养和早期断奶[1-2]。然而，母乳中包含大量对婴儿有益的生物活性物质，具有营养、抗菌及免疫调节等多种功能，对母亲而言可以帮助子宫收缩、减少乳腺癌和卵巢癌等的危险[3]。因此，乳头皲裂的治疗对推进母乳喂养显得至关重要。

中医验方蛋黄油，古籍中称为“雏凤膏”，性平，味甘，具有解毒消肿，敛疮生肌之效[4]。蛋黄油的临床应用历史悠久，始见于北周姚僧垣撰《集验方·卷九》，云：“治汤火烧疮方，熟鸡子一十个，取黄，炒取油，入十文腻粉，搅匀，用鸡翎扫疮上，三、五日，永除瘢痕”[5]。此外在《本草纲目》等诸多书籍中均有记载[6]。研究表明，蛋黄油中含有脂肪类、蛋白质氨基酸类、维生素、矿物质四类成分，其中维生素A、维生素D和卵磷脂等物质对人体皮肤的再生和代谢有着重要作用[7]。此外，雏凤膏中还添加有芝麻油和纯天然羊毛脂。关于蛋黄油用于烫伤、乳头皲裂等的研究[8-10]已有报道，但是雏凤膏治疗乳头皲裂的具体机制研究还未见报道。研究针对雏凤膏对乳腺上皮细胞MCF 10A细胞的增殖影响及机制展开深入的探究，希望为雏凤膏应用于乳头皲裂的治疗提供理论依据，从而进一步推进母乳喂养。

1 材料

1.1 细胞 乳腺上皮细胞MCF 10A购买于中国科学院上海细胞库

1.2 雏凤膏的制备 蛋黄油提取物1份;芝麻油0.5～1.5份;纯天然羊毛脂1.5～2.5份。其中，所述的蛋黄油提取物的制备方法如下：

将鸡蛋煮熟，剥取蛋黄，压碎，用食品级乙酸乙酯冷浸或超声提取，得到的提取液减压回收乙酸乙酯，得到所述的蛋黄油提取物。

取纯羊毛脂4份，置于容器中，加热至约45?C，将羊毛脂熔化，再加入2份蛋黄油中间体，1份芝麻油基质，熔合，不断搅拌，冷却至室温，即得雏凤膏。

1.3 试剂 MCF 10A专用培养基(Lonza公司批号cc-4136)；0.25% Trypsin-EDTA (GENVIEW 公司批号49120010100)；青霉素-链霉素(吉诺生物医药技术有限公司批号12123101)；RIPA裂解液(碧云天生物批号P0013C)；碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司批号P0011)；四甲基亚唑蓝(MTT)(美国SIGMA公司批号M2128)；DMSO(美国SIGMA公司批号WXBB1799V)；细胞周期染色液(BD公司批号 5205995)；一抗cyclin E1、cdk2(戴格生物科技生物有限公司批号 db1668、db299、)、p21(abcam公司批号 18209)、β-Actin、β-Tubulin(CST公司批号 #4970、#2128)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(BIO-RAD公司批号350001312)；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(BIO-RAD公司批号350003248)；ECL显影液(BIO-RAD公司批号102030719)

1.4 仪器 3111型二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；SW-CJ-1FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；ECLIPSE Ti型荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；BSA124S-CW电子天平(北京赛多利斯电子有限公司)；L500型台式离心机(湖南相仪实验室仪器开发有限公司)；HHS-11-1型恒温水浴箱(上海博迅医疗设备厂)；MDF-U3386S 型超低温冰箱(日本Sanyo公司)；转移脱色摇床(姜堰市普康医疗机械厂)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；化学发光成像系统(中国CLinX公司)；guava流式细胞仪(美国Minipore公司)；移液枪(多规格)(德国Eppendorf公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 MCF 10A细胞株培养于MCF 10A专用培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2天换液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，大豆胰蛋白酶抑制剂抑制消化，按1∶3传代，置37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养用于后续实验。

2.2 MTT法检测细胞相对存活率 收集对数期细胞，调整细胞密度为2000个/孔，每孔100 μL加入到96孔板，置37 ℃含有5% CO2培养箱培养。待细胞贴壁后加入雏凤膏，其药液终浓度分别为0 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1,用药组和对照组均设8个复孔继续培养96 h，每孔加入20 μL浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液，置于培养箱中继续培养，4 h 后每孔加入 200 μL 三联液使蓝紫色结晶甲瓒溶解，18 h 后用酶标仪在 570 nm 处测定其 OD 值。重复实验3次，以平均值统计结果，计算各浓度下细胞相对存活率。细胞活力(%)=(加药组OD570-空白组OD570)/(对照组OD570-空白组OD570)×100%。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 实验分组：对照组、60 μg·mL-1雏凤膏组、120 μg·mL-1雏凤膏组。将状态良好的乳腺上皮细胞MCF 10A以3×105/孔传代于6 cm皿中，等待细胞贴壁之后，按照分组的情况加入含有不同浓度的雏凤膏的完全培养基，继续培养96 h后用PBS洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重悬细胞，洗涤离心后立即加入70%的冰乙醇，保存在4 ℃过夜，细胞固定好之后，将前一天的细胞悬液在离心机上离心，吸去用于固定的乙醇，再用冷的PBS洗涤细胞两次，除去上清液，加入含有RNase的PI染液，避光室温染色30 min，流式细胞仪检测每组细胞中的荧光强度，独立实验重复3次。

2.4 Western Blot检测细胞周期相关蛋白及与生长有关蛋白 实验分组：对照组、60 μg·mL-1雏凤膏组、120 μg·mL-1雏凤膏组。将状态良好的乳腺上皮细胞MCF 10A以3×105/孔传代于6 cm培养皿中，等待细胞贴壁之后，按照分组的情况加入含有不同浓度的雏凤膏的完全培养基，继续培养96 h后，各组细胞加入裂解液，冰上裂解30 min后离心(12000 r·min-1)取上清，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，处理蛋白随后上样，用SDS-PAGE分离总蛋白，随后用湿转法转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Cyclin E1、Cdk2、p21、EGFR、p-EGFR、Erk、p-Erk、GAPDH抗体孵育过夜后，加入相对的二抗(1∶3000稀释)，室温孵育2 h，ECL法显影，化学发光后拍照。GAPDH用于蛋白的内参。

2.5 统计学处理 每组实验重复3次，实验结果用SPSS 22.0统计软件进行分析，采用两独立样本t检验统计学方法，当*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001时差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 雏凤膏对MCF 10A细胞增殖活性的影响 用不同浓度的药物雏凤膏(0，5，10，20，40,80,160 μg·mL-1)处理MCF 10A细胞72 h后，采用MTT法检测细胞增殖活力，并绘制量效曲线(表1、图1)。通过MTT实验发现雏凤膏对乳腺上皮细胞MCF 10A具有明显的增殖作用并具有剂量依赖性。

3.2 雏凤膏对乳腺上皮细胞MCF 10A周期的影响

3.2.1 流式细胞仪检测细胞周期实验结果 本研究采用不同浓度的雏凤膏对MCF 10A细胞处理72 h后用PI单染，流式细胞仪检测细胞周期变化情况，结果显示，雏凤膏能加快MCF 10A的G1/S期转换，增加其S期细胞数目，见表2、图2。

表1 雏凤膏对乳腺上皮细胞MCF 10A细胞活力的影响

表2 不同浓度的雏凤膏 (0、60、120 μg·mL-1)处理72 h后，流式细胞仪检测MCF 10A细胞周期变化

3.2.2 Western Blot检测周期相关蛋白 Western Blot 结果显示(表3、图3)，用雏凤膏处理72 h后的MCF 10A细胞G1/S期相关蛋白Cyclin E1，cdk2以及p21的表达发生了变化。Cyclin E1，cdk2 蛋白表达水平升高，p21蛋白表达水平降低，表明雏凤膏促进乳腺上皮细胞MCF 10A增殖是通过加快细胞周期转换实现的。

3.3 雏凤膏对乳腺上皮细胞MCF 10A EGFR/Erk通路的影响

3.3.1 Western Blot检测EGFR/Erk通路相关蛋白 Western Blot 结果显示(表4、图4)，用雏凤膏处理72h后的MCF 10A细胞EGFR/Erk通路相关蛋白表达发生变化。即p-EGFR、p-Erk蛋白表达升高，表明雏凤膏促进MCF 10A增殖可能与EGFR/Erk通路有关。

表3 不同浓度的雏凤膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A细胞72 h后，Image J 计算cyclin E1、cdk2、p21蛋白的总灰度值变化，β-tubulin 作为内参对照。

表4 不同浓度的雏凤膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A细胞72 h后，Image J 计算p-EGFR、EGFR、p-Erk、Erk蛋白的总灰度值变化，β-actin 作为内参对照。

4 讨论

乳头皲裂作为哺乳期的常见病之一，已经成为产妇放弃母乳喂养的主要原因之一，虽已有药物治疗乳头皲裂，但考虑到里面的添加剂对婴儿的危害，大多数产妇不愿使用，而雏凤膏作为一种中医验方，来源纯天然、没有添加剂、无毒副作用，具有“生肌长肉”的功效。本实验利用MTT实验发现，雏凤膏对于乳腺上皮细胞MCF 10A具有明显的增殖作用，并且呈现剂量依赖性。随后，对雏凤膏促进乳腺上皮细胞的机制进行研究。而细胞生长、增殖的调控主要跟细胞周期和信号通路等有关。

细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，从而实现细胞的增殖，包括G1、S、G2、M四个阶段。在G1/S与G2/M两个过渡期各有一个检查点，分别制止G1期受损DNA进入S期进行复制和G2期受损DNA进入M期进行有丝分裂，从而中止细胞周期[11]。流式细胞术结果显示雏凤膏能够使MCF 10A细胞雏凤膏能加快MCF 10A的G1/S期转换，增加其S期细胞数目，达到促进增殖的作用。细胞周期受细胞精确、有序的调控，其中，细胞周期蛋白E( cyclin E)、周期蛋白依赖性激酶2(cyclin- dependent kinase 2, cdk 2) 是细胞周期调控中的关键大分子之一，cyclin E与cdk2结合，成为细胞从G1进入S期的关键激酶复合物[12-14]P21蛋白能够抑制各种Cyclin E-cdk 2复合物的活性，负性调节Cyclin E- cdk 2 功能。Western Blot结果显示雏凤膏能够引起MCF 10A细胞G1/S期相关蛋白表达的变化，即上调cyclin E1、cdk 2的表达，下调p21的表达，表明雏凤膏通过加快MCF 10A细胞G1/S期的转换，加快细胞周期进程，达到促进增殖的目的。

表皮生长因子(EGFR)作为一种膜受体，二聚体化和磷酸化后，与其下游相应的信号转导分子发生相互作用，并将其激活。这些信号通路包括MEK/ERK及PI3K/AKT 信号通路等[15-16]，通过这些信号通路将有丝分裂的信号从细胞外传递到细胞内，从而有效调节细胞增生、分化及生长等[17-18]。基于上述EGFR对细胞生长、增殖的调控作用，我们推测雏凤膏的促进乳腺上皮细胞增殖可能与促进EGFR的活化有关。Western Blot结果显示雏凤膏能够促进MCF 10A 的EGFR的磷酸化，并且还同时促进Erk的磷酸化，且呈现明显的剂量依赖性。因此，推测雏凤膏促进MCF 10A的增殖可能与激活EGFR/Erk通路有关。

雏凤膏作为一种中医验方，纯天然、无毒，营养丰富，本实验发现雏凤膏可以促进乳腺上皮细胞的增殖，其机制可能与缩短细胞周期、激活EGFR/Erk通路有关，希望为雏凤膏临床治疗乳头皲裂提供理论依据，从而推进母乳喂养。