天虹*

1.成都中医药大学管理学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137；3.西藏藏医学院，西藏 拉萨 850000

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)属于藏医“真布病”范畴，在藏区是一种常见疑难性疾病，其发病率高，致残率高，并可累及多器官、多系统引起系统性疾病。藏药浴疗法是藏医治疗RA临床效果确切的常用手段，其在治疗风湿病、类风湿病、关节病等方面疗效显著。藏药浴最基本的经典组方是记载于《四部医典》的“五味甘露方”。临床数据表明，藏药浴疗法可以提高RA患者的免疫功能，具有显著的抗炎镇痛效果[1-3]。但是五味甘露药浴颗粒对类风湿关节炎的相关药效机制报道相对缺乏[4-5]，其对RA滑膜细胞以及关节功能和形态的干预作用的具体机制尚不清楚。因此，本实验在藏医学理论和临床治疗经验的指导下，建立佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA)大鼠模型，观察五味甘露药浴颗粒对致炎侧足趾肿胀度、足踝关节滑膜病理改变等药效作用。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 健康雄性SD种大鼠(SPF级)60只(购自成都达硕生物科技有限公司)，体重(200±20)g，日龄(40±5)d。实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24。在成都中医药大学动物实验室适应性饲养1周之后实验。

1.3 材料 弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvant，规格：1 mg/mL，灭活结核杆菌，批号：#SLBF 9338V，Sigma公司)。卡介苗冻干粉(规格：60 mg/支，批号：201409，上海瑞楚生物科技有限公司)。1 mg·mL-1弗氏完全佐剂中加入一定剂量灭活的卡介菌，制备成10 mg/mL灭活结核杆菌的弗氏完全佐剂，4 ℃冷藏保存备用。醋酸地塞米松片(Dexamethasone Acetate Tablets，规格：0.75 mg/片，批号：130123，由浙江仙琚制药股份有限公司)。

1.4 仪器 PV-200足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)；徕卡-2016转轮式切片机(德国徕卡(Leica)仪器有限公司)；BA400Digital数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪(美国Thermo公司)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)。

2 方法

2.1 AA模型大鼠的建立及给药方案 将实验动物按体重随机分为6组，每组10只：①正常对照组(C)；②AA模型对照组(AA)；③地塞米松组(D)；④五味甘露药浴高剂量组(H)；⑤五味甘露药浴中剂量组(M)；⑥五味甘露药浴低剂量组(L)。参照文献[6-7]，于正常对照组(C)大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL生理盐水，其它五组(AA组、D组、H组、M组、L组)每只大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL弗氏完全佐剂，建立佐剂性关节炎大鼠模型。在致炎两周后，对H组、M组和L组大鼠进行五味甘露药浴疗法。将这三组大鼠固定于底部直径约30 cm，高约20 cm的圆柱形木桶内，使大鼠双侧下肢浸泡在2 L的药液中，药液的浓度分别为：H组11.80 g/L、M组5.90 g/L、L组2.95 g/L，水温控制在38～42 ℃，每天1次，每次30 min。药浴7 d为1个疗程，连续治疗4个疗程，每个疗程结束休息2d。C组和AA组每天同体积淡水温水浴，给药条件同五味甘露药浴组。D组每天醋酸地塞米松0.15 mg/kg灌胃1次，给药疗程参照五味甘露药浴组。

2.2 指标检测

2.2.1 足容积测量 造模前用足容积测量仪对每只大鼠右后足足容积测量2次，取两次测量值的平均数作为基础值。大鼠造模两周后开始给药，分别于给药第1周、第2周、第3周、第4周测定致炎侧(右后足)足容积，计算出原发性足肿胀度(△mL=致炎后足容积平均值-致炎前足容积的平均值)[8]。

2.2.2 免疫器官脏器系数 大鼠造模成功，并连续用药四周。实验结束后，先对各组大鼠称体重、记录。采用麻醉方法处死大鼠，摘取胸腺、脾脏分别在电子天平上精密称重、记录。用公式：脏器系数=脏器湿重(mg)/动物体重(g)×100%，计算脏器系数。

2.2.3 大鼠踝关节滑膜病理学观察 麻醉取血处死大鼠，取右侧后足(致炎侧)踝关节，沿关节正中切开皮肤，暴露出以踝关节为中心的约3 cm×3 cm区域，有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，剥离部分组织，制备石蜡切片。切片常规脱蜡后放染色架上，放入苏木精染液缸染色10～20 min，水洗后入1 %的盐酸内分色30 s。水洗后取出放50 ℃的温水中或弱碱性水溶液反蓝，出现蓝色后水洗，镜检染色效果，细胞核呈蓝色，胞浆不着色。放伊红染液缸内染色，用75 %～95 %浓度梯度乙醇逐级脱水，然后透明、封片。以常规光学显微镜观察，并以图像分析系统测定积分光密度，观察滑膜组织的病理变化。

3 结果

3.1 足容积测量结果 与正常对照组比较，AA模型对照组大鼠右后足于注射弗氏完全佐剂后产生明显肿胀(P<0.01)，右后足足肿胀在致炎两周左右达到峰值。与AA模型对照组比较，地塞米松组与五味甘露药浴颗粒低剂量组在给药1至4周原发性足跖肿胀度均有显著的减小(P<0.01)；五味甘露药浴颗粒中剂量组、五味甘露药浴高剂量组也能明显的抑制大鼠的原发性足肿胀(P<0.05)。见表1、图1。

组别剂量足肿胀度(△mL)给药前给药一周给药二周给药三周给药四周正常对照-0.194±0.097∗∗0.033±0.128∗∗0.105±0.083∗∗0.131±0.137∗∗0.080±0.185∗∗模型对照-1.714±0.3111.609±0.2591.556±0.3591.384±0.2791.267±0.362地塞米松0.15mg·kg-11.620±0.3150.589±0.318▲▲0.613±0.432▲▲0.416±0.244▲▲0.619±0.334▲▲五味甘露药浴颗粒2.95g·L-11.429±0.368 1.082±0.316▲▲1.061±0.391▲▲0.860±0.440▲▲0.762±0.312▲▲5.90g·L-11.582±0.2921.341±0.288▲1.148±0.211▲▲1.041±0.260▲0.873±0.377▲11.80 g·L-11.792±0.4361.482±0.3601.266±0.197▲1.078±0.326▲0.927±0.324▲

注：正常组与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01；给药组与模型组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01。

3.2 免疫器官脏器系数 与正常组对照组比较，AA模型对照组脾脏系数显著增大(P<0.01)。与AA模型对照组相比，地塞米松组胸腺系数显著减小(P<0.01)；五味甘露药浴颗粒高、中、低剂量组大鼠免疫器官没有明显的变化(P>0.05)。见表2、图2。

组别剂量胸腺系数脾脏系数正常对照-0.098±0.0250.201±0.026∗∗模型对照-0.094±0.0200.238±0.026地塞米松0.15mg·kg-10.052±0.015▲▲0.237±0.062五味甘露药浴颗粒2.95g·L-10.103±0.0230.269±0.0835.90g·L-10.100±0.0250.255±0.04611.80 g·L-10.116±0.0270.267±0.039

注：正常组与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01；给药组与模型组比较，▲P<0.05、▲▲P<0.01。

3.3 大鼠踝关节滑膜病理学观察 正常对照组(C)大鼠滑膜组织滑膜细胞单层，排列整齐，无血管增生，无纤维化，无乳头状增生；软骨组织结构层次清晰，骨小梁整齐、排列有序，无断裂、扭曲，未见滑膜细胞增生增厚、巨噬细胞增生和间质炎细胞浸润部分。AA模型对照组(AA)滑膜细胞多层，增生活跃，滑膜组织中纤维组织增生，毛细血管增多扩张充血，可见大量炎细胞及纤维母细胞浸润，软骨组织表面基本完整，局部细胞弥漫增生簇集。地塞米松组(D)滑膜细胞增生，细胞层数稍有增加，滑膜组织中纤维组织增生，毛细血管增多扩张充血，可见炎细胞及纤维母细胞浸润。

五味甘露药浴颗粒高剂量组(H)滑膜细胞增生，细胞层数稍有增加，滑膜组织中纤维组织轻度增生，毛细血管增多扩张充血，可见炎细胞浸润及纤维母细胞样细胞浸润, 软骨组织表面基本完整，局部细胞弥漫增生簇集，潮线基本完整，未见有软骨下血管入侵潮线。五味甘露药浴颗粒低剂量组(L)滑膜细胞增生，细胞层数较高剂量组明显增加，滑膜组织中纤维组织大量增生，毛细血管增多扩张充血，可见淋巴、单核细胞及纤维母细胞样细胞浸润, 软骨组织表面基本完整，局部细胞弥漫增生簇集，潮线基本完整出现多重潮线，偶见有软骨下血管入侵潮线。五味甘露药浴颗粒中剂量组(M)滑膜细胞增生，细胞层数明显增加，滑膜组织中纤维组织增生，毛细血管增多扩张充血，可见淋巴、单核细胞及纤维母细胞样细胞浸润, 软骨组织表面基本完整，病变程度介于高剂量组及低剂量组之间，见图3。

4 讨论

RA是一种以慢性滑膜炎症导致进行性关节损害为特征的疑难疾病，其发病率高，致残率高，并可累及多器官、多系统引起系统性疾病[9]。现代医学对RA的治疗目标主要是让患者尽早达到症状缓解状态并长期维持稳定[10]。目前应用于治疗RA的常规药物，如非甾类抗炎药(NSAIDS)、慢作用抗风湿药、免疫抑制剂、糖皮质激素(GC)等[11-12]，主要侧重于治疗炎症和关节软组织肿胀，但不能有效地防止软骨破坏，且有一定的毒副作用。

类风湿关节炎的炎症主要累及身体各处关节，临床体征一般表现为手、足、腕、踝等小关节和肘、肩、髋、膝等大关节的红、肿、热、痛的炎症反应，以及关节部位的畸形、类风湿结节的出现和类风湿血管炎的表现等。本实验中AA模型大鼠佐剂性关节炎在体征上表现为致炎侧关节的原发性足肿胀，足趾端出现坏死、皮肤溃疡，尾部有类风湿结节的出现。经五味甘露药浴颗粒治疗后，原发性足肿胀有明显下降的趋势，踝关节病理形态有所改善，大鼠的胸腺、脾脏系数有升高的趋势，提示该药可以明显减轻关节炎症程度，增强机体的免疫功能，对类风湿关节具有抗炎消肿的治疗作用。