田剑刚 钟翠翠 黄瑞哲 张盘谏 陈庆秀 阮建平

(1.西安交通大学口腔医院预防科,陕西 西安 710004；2. 山东省阳谷县人民医院口腔科，山东 阳谷 252300；3.西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西 西安 710004)

氟牙症的形成是由于牙齿发育期摄入过量的氟化物，导致釉质发育不全而釉质表现白垩色条纹、斑块、缺损等。目前认为釉原蛋白水解延迟和清除障碍是导致氟牙症形成的原因，从而影响了相关蛋白的表达，但具体的作用机制尚不清楚[1]。泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白水解的重要途径之一，其介导的细胞内蛋白选择性降解是细胞调控的重要机制。泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)作为泛素-蛋白酶体途径中的泛素再循环酶，曾被观察到出现于分泌期的成釉细胞内，提示泛素-蛋白酶体途径可能在釉质的形成中具有一定的作用[2]。本研究通过免疫组化和实时定量PCR方法观察氟化物对其表达的影响，为进一步探索氟牙症的形成机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 12周龄清洁级SD大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心)；兔抗大鼠UCH-L1一抗(Biomol Company，USA)；即用型SABC试剂盒及DAB 显色试剂盒(博士德生物工程有限公司)；RNA FAST200试剂盒(上海飞捷公司)； PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMII PCR试剂盒(TaKaRa公司)；GAPDH引物(北京奥科鼎盛生物公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 氟中毒动物模型的建立与取材 按本实验组已有的方法[3]，将9只妊娠10 天的大鼠随机分为对照组、低氟组和高氟组，每组3只，分别饲以去离子水和浓度为50、200 mg/L的含氟饮水,建立仔鼠成釉细胞氟中毒模型。待妊娠21 天时，乙醚麻醉下，随机选取10只胎鼠，切取下颌第一磨牙牙胚部位的下颌骨段，在4 % PFA中固定，石蜡包埋。其余胎鼠取下颌第一磨牙牙胚，采用Trizon法提取总RNA。

1.2.2 免疫组化染色及结果判定 每组10个蜡块做连续5 μm切片，HE染色，光镜下观察定位成釉器。采用SABC法免疫组化染色，主要步骤包括：切片脱蜡至水，3%过氧化氢液室温30 min灭活内源性过氧化物酶，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中采用微波法修复抗原，5%BSA封闭液60 μl封闭抗原，滴加一抗在湿盒内4 ℃过夜孵育，滴加二抗在湿盒内37℃孵育60min，滴加SABC室温孵育40 min，新鲜配置DAB显色液显色1 min，蒸馏水洗片，苏木素轻度复染，脱水透明封片，光镜下观察。染色结果判定：以PBS染色作为阴性对照，UCH-L1的阳性染色为在成釉细胞胞质及釉质基质内可见棕黄色颗粒。每组10个样本中选择杂质少、牙胚组织完整且未复染的SABC染色切片各一张，同一感光条件下，每张切片在其阳性染色区域内随机选取不重叠的6个视野区域进行图像采集，每个视野保存为1张图片。采用Image-Pro Plus 5.1测量染色光密度值，每张切片所测得的6个视野的均值代表该样本蛋白的表达水平，每组10个样本的均值代表该组的平均蛋白表达水平。

1.2.3 实时定量PCR 以牙胚提取的总RNA逆转录的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，用于UCH-L1 mRNA的检测。引物序列：内参对照GAPDH-upper-5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′; GAPDH-lower-5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；UCH-L1-upper 5′-GGGGGTTTGGTTTGTATTATTTT-3′；UCH L1-lower 5′-CCACCTCCATTACACAAAAC-3′。逆转录体系：5×PrimeScriptBuffer 2μl，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 0.5μl，Oligo dT Primer(50μM)0.5μl， Random 6 mers(100 μM)0.5μl，加无RNA酶水至总体积10μl。PCR扩增体系：SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)10μl，PCR Forward Primer(10μM)0.8μl，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μl， ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4μl，待测样品cDNA2μl，加无RNA酶水至总体积20μl。反应条件：预变性为95℃进行30s，之后变性为95℃进行5s，退火后60℃延伸30s，进行40个循环后结束。每个样本做3个复孔，重复3次。计算各组ΔCT均值，比较目的基因在各组之间的表达差异。

1.3 统计学分析 采用SPSS 12.0 统计学软件对所得3组图像分析数据及各组ΔCt值进行单因素方差分析，检验水准α= 0. 05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下观察 镜下可见牙胚成釉细胞呈高柱状单层排列，牙尖部位的成釉细胞已开始分泌少量釉基质蛋白。与之相对应成牙本质细胞也呈单层排列在基底膜的另一侧，并也开始分泌牙本质基质蛋白。对照组胎鼠成釉细胞胞浆黄染，染色较为均匀，说明此时UCH-L1在成釉细胞表达呈阳性；低氟组胎鼠成釉细胞间隙较对照组增大，胞浆黄染减弱；高氟组胎鼠成釉细胞排列不齐，细胞间隙增大，并且形成囊泡，成釉细胞胞浆黄染较对照组明显减弱，且染色不均，甚至消失，见图1。

图1 各组牙胚中成釉细胞UCH-L1的表达染色情况(SABC染色，×400)Figure 1 Immunohistochemical results of UCH-L1注：A.对照组；B.低氟组；C.高氟组

2.2 图像分析 切片中阳性表达水平强则标本染色深、透光弱、光密度值低；反之，则标本染色浅，透光强，光密度值高。测得各组灰度值结果。由单因素方差分析得出，3组大鼠之间UCH-L1表达的光密度值不全相同，差异有统计学意义(F=109.102，P<0.01)；经过SNK法两两比较，各组之间的灰度值差异具有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1各组中UCH-L1表达的平均光密度值

Table1TheaverageopticaldensityofUCH-L1indifferentfluoridegroups

分组n均值95%CI下限上限0 mg/L10167.9165.6170.350 mg/L10176.0173.5178.5200 mg/L 10189.0186.9191.1

2.3 实时定量PCR结果 UCH-L1、GAPDH PCR扩增曲线CT 阈值集中，且均在30个循环前到达荧光阈值，表明反应灵敏、过程稳定、各管定量精准；引物的溶解曲线求导曲线均为单一峰值，表明引物特异性良好，实验结果可靠。采用ΔCT 法计算目的基因UCH-L1的相对表达量，GAPDH作为内参对照，ΔCT= CT目的基因-CT内参，将3次重复实验中对照组的ΔCT相加取平均值作为ΔCT校正，对每组ΔCT均值进行统计学分析。ΔΔCT=ΔCT实验组-CT校正，根据公式可以算出目的基因在高氟(低氟)组的表达/目的基因在对照组的表达(2-ΔΔCT)。由单因素方差分析得出，3组大鼠之间UCH-L1表达的ΔCT均值不全相同，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2不同染氟组子鼠牙胚组织中UCH-L1mRNA的表达

Table2ThemRNAexpressionofUCH-L1intheToothgermofoffspringratsindifferentfluoridegroups

分组ΔCT 2-ΔΔCTFP0 mg/L8.191.00150 mg/L8.920.6021055.7240.000200 mg/L 10.590.189

3 讨论

成釉细胞的主要功能是合成及分泌釉基质蛋白，进而矿化形成牙釉质，目前认为氟牙症的发生与氟离子抑制了成釉细胞分泌相关的釉基质蛋白水解酶有关[4]。分泌性蛋白是在内质网中折叠、修饰后，形成有活性功能的蛋白质分泌到胞外。Kubota等[5]及Sharma等[6]研究证实，氟化物影响下成釉细胞中未折叠或错误折叠的蛋白质积累增多，导致内质网应激，进而激活未折叠蛋白反应(UPR)。泛素蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞降解变异蛋白、错误折叠蛋白及异常聚集蛋白等的主要途径之一，未折叠或错误折叠的蛋白质可进入内质网降解途径，被转运至胞浆中，通过UPS降解，从而降低内质网负担，维持细胞内的稳态[7-8]。Wei等[9]进一步研究发现，氟化物引起的内质网应激反应及UPR导致了釉基质蛋白水解酶合成分泌的减少，导致釉质中蛋白质的滞留。目前研究认为[10]内质网应激、UPR与氟牙症存在着某些共同因素的联系。当内质网应激持续存在的情况下，可引起细胞凋亡。已有许多研究证实氟影响下成釉细胞凋亡增加,路径各异[11-14]。因此，我们推测氟化物可能通过影响UPS，导致成釉细胞内质网中错误折叠与未折叠的蛋白不能及时降解而增多，进而加重内质网应激，使得细胞内稳态失衡，影响成釉细胞的功能，进而通过不同途径诱导细胞凋亡，引起一系列氟牙症的病理改变。

UCH-L1是一个由9个外显子编码，由223个氨基酸组成的硫醇蛋白酶，其基因定位于人类染色体4p14，是UCH 家族的四种蛋白之一，曾被称为蛋白基因产物9.5(PGP9.5)，被认为是神经组织的特异性蛋白而作为神经标记物[15]。随着对UPS研究的深入，UCH-L1的功能逐渐被人们所关注，并发现其不仅在神经系统的生理、病理中发挥特定的作用[16-17]，在多种疾病及肿瘤中也具有重要的作用[18]。对于UCH-L1的功能，一些研究认为UCH-L1使错误标记的底物蛋白去泛素化，从而阻止目标蛋白的水解[19]；也有另一些研究认为UCH-L1可使多聚泛素链从26S蛋白酶体上分离下来，这样目标蛋白被26S蛋白酶体降解，而使泛素释放并重新进入循环，从而促进目标蛋白的水解[20]。总体上目前普遍认为UCH-L1集三种功能于一身，不仅具有去泛素化功能，还有连接泛素及稳定单体泛素的功能，因此能够调节目标蛋白的降解速度[21]。目前UCH-L1 的蛋白含量、基因表达及作用是UPS的研究热点之一。

据前期研究观察，SD大鼠妊娠周期为21～22天，妊娠21天的胎鼠磨牙，牙胚处于钟状期[3]，此时成釉细胞处于分泌期，持续1～2天，分泌大量蛋白随后进入成熟期。UCH-L1的表达在此时处于牙胚发育各阶段的高峰[2]，因此本实验选择其作为研究对象，通过氟牙症动物模型，初步观察了在牙胚发育的釉基质蛋白分泌期氟化物对UCH-L1表达的影响。从实验结果可以看出，在氟中毒大鼠的成釉细胞中，无论从蛋白水平还是mRNA水平，UCH-L1的表达降低。表达的降低意味着功能的减弱，因此可以初步推断氟牙症发病过程中，UPS功能降低，导致未折叠及错误折叠的蛋白降解受阻而增多，出现内质网应激反应，这可能与UCH-L1受到氟化物影响有关。本实验还观察到，在氟中毒大鼠的成釉细胞中，高氟浓度组的UCH-L1表达较低氟浓度组进一步降低，可能存在剂量反应关系，这与氟牙症牙齿的临床表现随着摄入氟浓度的增高而加重是一致的。

4 结论

在氟中毒大鼠分泌期成釉细胞中，UCH-L1的表达降低，并且随着氟剂量的不同而表达降低的程度不同，说明氟化物对UCH-L1的表达有抑制作用。但此种影响是直接还是间接，其作用的分子机制如何，UPS在釉质发育中具体的作用机制以及氟化物对UPS通路各环节的影响，仍需进一步研究。