尹洪旭，杨艳芹，姚月凤，张铭铭，王家勤，江用文，袁海波*



栗香绿茶香气萃取方法优化及其芳香成分分析

尹洪旭1,2，杨艳芹1，姚月凤1,2，张铭铭1,2，王家勤1,2，江用文1，袁海波1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所 浙江省茶叶加工工程重点实验室，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

以14个具典型栗香特征和2个甜香特征的绿茶茶样为研究对象，比较了固相微萃取头种类、萃取温度、萃取时间及电解质浓度对栗香香气物质种类和总量的影响，探索萃取栗香绿茶香气物质的适宜条件，并开展栗香绿茶的特征峰分析。结果表明，采用DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，在50℃下吸附50 min，电解质浓度控制为1~3 mg·mL-1时，能达到最佳的吸附效果；在该条件下，共检测出171种挥发性化合物，筛选出30个峰为栗香绿茶的共有特征峰，其中醇类5种、烯烃类4种，烷烃类7种，且各色谱峰相对峰面积的RSD≤5.0%，显示其具有较好的重复性。通过夹角余弦法和相关系数法进行相似度分析，证实栗香特征峰具有较好的解释能力。

绿茶；板栗香型；挥发性成分；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱

绿茶是我国六大茶类之一，是我国产销量最大、加工技术最为先进的茶叶品类[1]。就香气特征而言，我国绿茶香气可分为花香、清香、甜香、栗香等不同类型。栗香是一种类似于板栗的坚果香特征的香型，为中高档绿茶的典型香气。栗香的形成与茶树品种、原料品质、加工工艺等息息相关。如薛徐燕[2]专门选用梅占和奇兰品种制作栗香玉芽茶；叶飞等[3]研究表明，汽热-滚筒联合杀青有助于形成栗香品质。吕连梅等[4]提出炒干方式加工的产品更易于呈现栗香。

目前对茶叶香气检测分析的研究有较多报道，但大多数为不同萃取方法的综合比较，针对某一特定香型的研究报道甚少[5-6]。不同香型茶叶的主要特征性香气物质存在较大差距，如花香的特征成分以芳樟醇、香叶醇、茉莉酮等为主，果香以沉香醇、紫罗酮等为主[7-8]，由于分子量、分子结构及沸点等差异，不同香气组分的萃取要求亦不相同。至今，绿茶栗香特征化合物尚不明确，特定的萃取优化方法亦未建立；笔者认为，可能正是由于萃取方法的欠缺，导致特征物质在制备过程中有所缺失，从而无法实现栗香香型的重构验证。

基于此，本论文以典型栗香绿茶为研究对象，以总峰面积为判断标准，对绿茶典型的栗香香型开展萃取方法的系统研究，拟获得针对此香型绿茶香气物质萃取的优化参数，并据此开展后续系统分析，探索栗香绿茶共有特征成分，以期为其品质评价和香气调控提供理论指导和技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶样

北京吴裕泰茶业股份有限公司购置绿茶样品120个。

1.1.2 仪器

气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 6890N-5973型），250 mL的自制顶空微萃取瓶，SPME手柄以及DVB/CAR/PDMS、DVB/PDMS、PDMS、PA萃取头（美国Supe1co公司）、电加热磁力搅拌恒温夹套（无锡顺润公司）。

1.2 茶叶感官审评

建立5人感官审评小组，小组成员均为具有国家中级评茶员及以上资质的专业人员，采用GB/T 23776—2009的方法进行冲泡，着重对绿茶的香气特征进行审评，开汤后直接热嗅，记录香型特征，并对香气品质进行十分制打分（0~3分为差，＞3~5分为较差，＞5~7分为中等，＞7~9分较好，＞9~10分为好）。待茶样冷却至常温后，再次评定并记录香型特征及香气品质打分。

1.3 试验方法

1.3.1 香气萃取流程及条件优化设计

基于文献[9]中栗香绿茶的萃取方法进行参数优化。称取茶样（80目粉末）10.0 g，放入250 mL的自制顶空微萃取瓶中，在瓶中加入100 mg·L-1癸酸乙酯（内标）500 μL，100℃超纯水100 mL，以及一定量的NaCl，随后用打过孔的橡皮塞（经丙酮浸泡12 h，去味）塞紧，在特定温度的恒温夹套内采用磁力搅拌器搅拌加热（搅拌速度为450 r·min-1），水浴平衡5 min后，将带有萃取头（试验前老化5 min）的SPME手持器透过瓶盖橡皮塞插入自制顶空微萃取瓶中，于茶汤液面上空吸附特定时间，萃取完成后迅速将萃取头放入GC-MS进行热脱附解析检测。

选择3个得分最高的栗香绿茶作为试验原料，根据HS-SPME香气萃取流程对过程中的关键因子进行优化比较，具体设计见表1。

1.3.2 气相色谱-质谱条件

GC条件：采用DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气，纯度>99.999%，进样口温度：230℃，柱流速：1 mL·min-1，不分流。接口温度：250℃。离子源温度：250℃。离子化方式：EI。电子能量：70 eV。程序升温参数：50℃保持5 min，以2℃·min-1升至180℃，保持1 min，再以10℃·min-1升到230℃，保持2 min。

MS条件：离子源EI，离子源温度230℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，四级杆温度150℃，转接口温度280℃，电子倍增器电压350 V，质量扫描范围：35~400 amu。

1.3.3 GC-MS分析

由GC-MS分析得到的质谱数据与NIST 8.0 L标准谱库进行检索比对，查对有关质谱资料，从基峰、质核比和相对丰度等方面进行分析，根据出峰时间各个香气组分及各组分的相对含量。定量分析通过化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行计算，即以各香气组分的峰面积占内标物质峰面积之比值表示组分的相对含量。

质量控制：加入癸酸乙酯对整个萃取和检测过程进行监控，保证每个样品图中癸酸乙酯峰的保留时间变化率不超过1%，且峰面积变化率不超过10%。

表1 香气萃取条件优化设计表

1.4 数据处理

采用Origin Pro 8软件建立GC-MS指纹图谱；采用EXCEL 2007数据处理软件进行相似度分析。

2 结果与分析

2.1 感官审评结果

在收集到的120个绿茶样品中，经感官审评筛选出14个具有典型栗香特征茶样（两次结果均呈现栗香风味，且评分在8分以上的茶样才能作为试验茶样），2个甜香茶样。

目前，栗香绿茶尚未完全明确香型特征物质，本试验采用在典型栗香绿茶中萃取尽可能多的香气物质，以总峰面积为标准，在栗香香气集合中寻找共同栗香特征物质。

2.2 HS-SPME香气萃取条件优化

HS-SPME是一种集采样、萃取、浓缩、进样为一体，不使用有机溶剂，对挥发性物质有强富集作用的样品前处理技术，在食品、医药、农残、植物保护等领域有广泛应用。影响其萃取效果的因素主要包括萃取头类型、萃取时间和温度、电解质、pH值等[10]。

2.2.1 萃取头材料

萃取头的选择是香气萃取中极为关键的因素，除需具备热稳定性好、耐溶剂、耐酸碱[11]等特点外，还应与目标香气成分有较佳的“溶解性”。4种材料的固相微萃取头对香气物质总峰面积的影响如图1所示。由分析结果可知，DVB/CAR/PDMS萃取头所萃取栗香绿茶香气物质的总积分面积最大，显示其对该类型香气的吸附效果最佳，DVB/PDMS次之，PDMS和PA两种材料的吸附效果较弱。推测其原因可能在于，固相微萃取的基本原理是“相似相溶”，4种材料中PDMS为非极性萃取头，PA是极性萃取头，两者均只能单一地吸附茶叶中极性或非极性的香气物质，而DVB/CAR/PDMS兼有极性和非极性涂层，吸附范围较广，同时也说明栗香绿茶中极性和非极性香气物质均有一定含量。

2.2.2 萃取温度

香气物质在萃取纤维与基质间的分配系数受温度的影响。对HS-SPME而言，高温条件下可使香气物质的浓度增加，利于萃取，且能加强扩散和对流过程，缩短平衡时间，但温度升高会引起香气物质分配系数的下降，造成萃取头吸附能力降低[12]。不同的萃取温度对栗香绿茶香气成分萃取影响的结果如图2所示。从图中可以看到，萃取温度从40℃升高至50℃时，总峰面积快速提升，随后呈逐渐下降趋势，50℃和60℃处理间的差异相对较小，显示相对高温不利于栗香型绿茶香气的萃取，适宜的萃取温度为50℃。

注：香气萃取时加入电解质NaCl的量为0.1 g，萃取温度50℃，萃取时间为40 min。

注：香气萃取时选用DVB/CAR/PDMS萃取头，加入电解质NaCl的量为0.1 g，萃取时间为40 min。

2.2.3 萃取时间

萃取时间是试验结果具有良好重现性的重要保证，在萃取初始阶段，挥发性香气物质较容易被吸附到萃取头中，随着时间的延长，富集速度逐渐放缓，接近平衡状态时，即使延长萃取时间，对香气的富集亦极为有限[13]。从本试验结果分析（图3），萃取时间20~50 min，香气物质的总积分面积随着萃取时间延长不断增大，以20~30 min期间增幅最大，随后增加速率放缓。至60 min时，特征峰面积与50 min处理基本保持一致，显示此时吸附速率和扩散速率达到平衡，最终选取50 min作为最适宜萃取时间。

2.2.4 不同电解质浓度

茶汤中加入定量的电解质，有利于茶水溶液的化学环境产生极化作用，提高茶汤内的极性化合物的离子化水平，使得挥发性化合物的离逸能力增强[13]。本试验以NaCl为电解质，加入不同质量的NaCl电解质后，香气物质总特征峰面积的变化如图4所示。结果显示，与未加入电解质相比，加入电解质后处理样香气物质的总特征峰面积均有明显提升，表明其离子化水平有不同程度增强，但加入过多反而会导致总面积下降（4 mg·mL-1），可能与其对香气物质吸附造成一定干扰有关。相比较而言，电解质浓度控制在1~3 mg·mL-1时较为适宜。

注：香气萃取时选用DVB/CAR/PDMS萃取头，加入电解质NaCl的量为0.1 g，萃取温度为50℃。

注：香气萃取时选用DVB/CAR/PDMS萃取头，萃取时间为40 min，萃取温度为50℃。

Note: Extraction Fiber: DVB/CAR/PDMS. Extraction time: 40 min. Extraction temperature: 50℃.

图4 不同电解质浓度对茶挥发性成分萃取效果的影响

Fig. 4 Effect of Electrolyte concentration on the extraction of total volatile constituents

2.2.5 条件优化后的稳定性检测

为考察优化后方法的稳定性，选取香气品质评分最高的栗香茶样开展6次重复的香气萃取试验，萃取条件为：在水浴加热50℃的环境下，在100 mL茶汤（茶水比为1∶10）中加入0.1 g NaCl，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取头顶空萃取50 min后，迅速将萃取头放入GC-MS进行热脱附解析及检测。结果显示各色谱峰相对保留时间（=tri/trs，其中tri为待测峰的保留时间，trs为参照峰癸酸乙酯的保留时间）的相对标准偏差RSD≤1.0%，各色谱峰相对峰面积Sr（Sr=待测峰的峰面积/参照峰的峰面积）的相对标准偏差RSD≤5.0 %，表明该方法具有较好的稳定性。

2.3 基于优化方法的栗香绿茶共有特征峰分析

2.3.1 栗香绿茶共有特征峰的筛选

在最优条件下对14个栗香茶样进行GC-MS测定，从中鉴定出171种挥发性化合物。根据总离子流图中的峰数、保留时间、峰面积等参数以及成分鉴定结果，筛选出30个峰作为栗香绿茶的共有特征峰，如图5所示。

30个共有特征峰按出峰时间依次为：甲氧基苯基-肟、苯甲醛、苯甲醇、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、芳樟醇、苯乙醇、3-甲基十一烷、萘、3-亚甲基十一烷、水杨酸甲酯、香叶醇、壬酸、2-甲基萘、吲哚、十三烷、1-甲基萘、-荜澄茄油烯、3-甲基-十三烷、2,6,10-三甲基十二烷、()-己酸-3-己烯酯、十四烷、杜松烯、2-甲氧基乙酸十四烷基酯、-紫罗酮、-法尼烯、2,6-二叔丁基对甲酚、1,2,3,4,4a,7-六氢-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘、咖啡碱、棕榈酸和植醇。其中烷烃类物质有7种，醇类5种、烯烃类4种，芳香烃、酯类、其他类香气物质各有3种。

共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积值如表2所示。从表中可以看到，就相对保留时间而言，共有特征峰介于0.273 3~1.584 8，主要集中于0.176 5~1.423 7，相对峰面积的平均值则介于0.006 4~0.242 4，其中相对高含量的香气物质（相对峰面积大于等于0.1）包括2,2,4,6,6-五甲基庚烷、芳樟醇、香叶醇、()-己酸-3-己烯酯、十四烷、杜松烯、2,6-二叔丁基对甲酚等。就香气特征而言，共有特征峰中有19个组分具有特殊的香气特征[14]，有木香、花香、果香、烘烤香等，其对栗香绿茶香型形成的贡献还有待进一步深入研究。

2.4 栗香绿茶共有特征峰与甜香绿茶峰值相似度比较

对甜香绿茶进行GC-MS检测，采用夹角余弦法和相关系数法[15]将其与栗香绿茶共有特征峰的相似度进行分析，以验证特征峰对栗香绿茶香气组成的代表性，结果见表3。

从表中可以看出，栗香绿茶30个特征峰的夹角余弦相似度在0.880 7~0.982 3，除2个茶样外，其他茶样相似度均大于90%，平均相似度达到0.939 8，处于较高水平；相关系数则在0.854 3~0.981 8，平均值为0.945 6，基本符合植物特征峰谱图的相似度要求。甜香绿茶中30个特征峰夹角余弦的相似度在0.757 8~ 0.779 1，平均相似度为0.768 5，与栗香绿茶的平均相似度相差达到0.171 3；其相似度相关系数的平均值（0.706）亦与栗香绿茶的结果同样相差较大，显示栗香绿茶特征峰谱图能够较好对两者进行判别，在一定程度上说明该特征峰具有较好的解释能力。

3 讨论

SPME因其具有方便快捷，灵敏度高，选择性与重现性好，且能较真实地反映样品尤其是自身特性等优点，广泛应用于食品香气的分析研究[16-17]，在茶叶香气萃取和检测方面，目前主要以SPME与GC-MS联用为主[18-19]。例如Wu等[20]在研究伍家台富硒绿茶特征香气物质时，运用SPME-GC-MS定性得到94种挥发性成分，在普洱茶[21]、红茶[22]等茶类中也有广泛运用。随着香气检测技术的快速发展，SPME与全二维气相色谱飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）的组合是目前萃取检测香气组分较为先进的手段，朱荫等[23]利用此方法确定了西湖龙井茶中522个共有香气组分，显示其定性能力较一维色谱提高了5倍以上。此外，SPME/GC-O技术可以用来确定食品关键成分，对确定香味化合物的强度和作用大小具有重要的参考价值，如苗爱清等[24]利用该技术确定了白叶单枞茶、金萱、铁观音、黄金桂4种品种乌龙茶的关键成分。

图5 栗香型绿茶GC-MS指纹图谱

表2 栗香绿茶共有特征峰分析

表3 栗香与甜香绿茶峰值相似度分析

针对栗香绿茶的已有报道中，叶国柱等[9]发现-紫罗酮、植醇、芳樟醇等在区分栗香型和非栗香茶样时达到显著性水平，试验时我们亦发现总峰面积最高的处理，此三者的峰面积和亦为最大，显示其对栗香香型的显现作用较大。本文提出的栗香挥发性特征成分中，醇类和萜烯类、醛类、酯类等具有较好的香气品质，这些成分也是栗香绿茶中重要的嗅感物质，可能对栗香绿茶的“熟栗香”、“嫩玉米”品质特征的形成起着直接促进作用。栗香在香气审评中往往跟高香绿茶接近，已有研究[25]显示，芳樟醇、水杨酸甲酯、()-己酸-3-己烯酯、香叶醇、-法尼烯是高香绿茶区别于普通烘青绿茶特征香气的关键物质，上述成分在本研究中也有检出，进而体现栗香绿茶“香高”的风味特征。

茶叶香型是由众多特征香气组分按照一定比例相互作用形成的整体感官感受，其表现受香气组分种类、含量、阈值以及相互间互作效应等多种因素的影响。因此我们认为，在筛选出的30种栗香特征成分中，其中的一些成分可能在感官上与栗香并不相似，但同样存在参与栗香形成的可能。例如芳樟醇、香叶醇具有铃兰系清淡爽快、蔷薇系温和的花香，且两种物质互为异构体[26]；经互作作用会产生不一样的风味；而且同一香气物质，在不同香气浓度下亦会显现出不同香味特色，因此有必要在此基础上针对香味阈值、香气活度值等更深层次的显味效应展开研究，并借助重构模拟实现栗香特征的精准调控。

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Optimization of AromaExtraction and Aroma Component Analysis on Chestnut-like Green Tea

YIN Hongxu1,2, YANG Yanqin1, YAO Yuefeng1,2, ZHANG Mingming1,2, WANG Jiaqin1,2, JIANG Yongwen1, YUAN Haibo1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tea Processing Engineer of Zhejiang Province, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China

Fourteen green tea samples with typical chestnut-like aroma and 2 samples with sweet aroma were used as materials and the optimal conditions including the type of extraction fiber, the extraction time, the extraction temperature and electrolyte concentration were selected by comparing the extraction effect of different conditions. The optimal conditions for preparing aroma of chestnut-like green tea were explored and the characteristic peak analysis of chestnut-like green tea was carried out. Results indicated that the optimal extraction conditions of chestnut-like green tea were as follows: extraction fiber DVB/CAR/PDMS, extraction temperature at 50℃, extraction for 50 min, electrolyte concentration of 1-3 mg·L-1. under this condition, 171 volatile compounds were detected and 30 peaks were identified as common characteristic peaks of chestnut-like green tea, including 5 alcohols, 4 alkenes, 7 alkanes. theRSDs of the relative peak areas were ≤5.0%, which showed a high repeatability. The similarity analysis of angle cosine method and correlation coefficient method proved that the characteristic peakscould well explain their contribution to chestnut-like fragrant.

green tea, chestnut-like aroma, volatile constituents, HS-SPME/GC-MS

TS272.5+1；O657.63

A

1000-369X(2018)05-518-09

2018-02-02

2018-03-06

国家自然科学基金（31471651）、浙江省自然科学基金（LQ18C160006）、中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

尹洪旭，男，硕士研究生，研究方向为茶叶加工工程。

192168092@tricaas.com