姚鹏程 屠秀强

(1 上海市格致中学 上海 201401； 2 浙江省绍兴市元培中学 绍兴 312000)

放射性同位素标记法也称放射性同位素示踪法，是指应用放射性同位素原子追踪物质的运行和变化规律，研究有机反应历程的方法。其依据的原理为放射性元素及它们的化合物与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质相同。因此，可用同位素作为一种标记代替相应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，即可用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等。高中生物学教材中光合作用中氧气的来源、卡尔文循环中碳的同化、T2噬菌体侵染细菌证明DNA是遗传物质、DNA的半保留复制以及分泌蛋白的合成及分泌途径的证实均运用到同位素标记法。而同位素标记法在生命科学理论研究中的应用远不止于此，本文将光合作用、遗传信息表达相关的、利用放射性同位素标记法进行的理论研究进行了梳理。

1 光合作用研究中同位素标记法的应用

18世纪后期，伴随着拉瓦锡新化学体系的建立，人类开始了对光合作用的认识。继1771年英国化学家普利斯特利(J. J. Priestley)通过把薄荷枝条和老鼠一同放入玻璃罩内生长的简单实验，首先发现植物可“净化”空气的现象，在短短35年内，“净化”空气所必需的几个重要因素——植物绿色物质、光、二氧化碳和水便分别为荷兰人英格豪斯(J. Ingenhousz)、瑞士牧师塞尼比尔(J. Senebier)及瑞士化学家索热尔(D.Saussure)所发现。19世纪30年代末，一系列关于动物细胞可固定二氧化碳的发现等种种事实表明：二氧化碳同化并非仅发生在自养生物中的一种特殊的光解反应，而很可能为一种酶促的暗反应。

随着放射性同位素示踪技术的应用，二氧化碳同化的过程也逐渐明朗，1937年，美国加州大学伯克利分校的鲁宾(S. Ruben)和卡门(M. D. Kamen)首先用放射性11C为示踪原子证明光合作用中二氧化碳固定是暗的酶促反应，只是由于11C半衰期太短且无合适方法分析二氧化碳受体而难以鉴定。而在前人已经探明光合作用反应物和生成物的前提下，鲁宾和卡门根据质量守恒定律，生成物中的原子来自反应物，光合作用产生的氧气必然来自反应物(水或二氧化碳)设计了实验。将18O分别标记H2O和CO2，使它们分别成为H218O和C18O2。进行两组实验：第一组向小球藻提供H218O和CO2，结果释放的氧气全部是18O2；第二组向植物提供H2O和C18O2，结果释放的氧气全部是O2。得出光合作用中产生的氧气来自于水。但这并没有解决二氧化碳同化的机制问题。

图1 卡尔文14C标记的双相纸层析放射自显影图谱

二次大战以后,长寿命的示踪原子已可投入实验室使用，为生物学工作者带来了福音。在伯克利分校的著名物理学家劳伦斯(E. O. Larence)建议下，一向对光合作用感兴趣的化学家卡尔文(M. Calvin)组建了一个新的生物—有机化学研究小组继续鲁宾等人的工作，用14C研究碳同化机制。卡尔文将培养出来的多组小球藻置于含未标记CO2的密闭容器中，将14C标记的14CO2注入容器，分别培养3s、 5s、 6s、 7s、 30s，将小球藻浸入热乙醇中杀死，使细胞中的酶变性失活，提取溶液里的含碳化合物分子。采取有机分析方法提取并鉴定全部含14C的标记物，卡尔文获得了有关碳循环的部分信息。在引入双相纸层折和放射性自显影等新方法后，使分析速度和精度大为提高，很快便分离、鉴定了一批在同化早期出现的糖磷酸(图1)。经不断分析、比较、修改与完善，卡尔文小组最终排列出了从第一个稳定产物——磷酸甘油酸到所有早期产物的相对位置，从而建立了最重要的生物合成反应——光合作用碳同化途径。不久，有关酶类也全被一一分离、纯化和证实，为后来对光合作用调节控制的探讨开辟了道路。

同时，1904年，植物学家哈伯兰特(G．Haberlandt)用光学显微镜观察一些草本植物时发现禾本科黍亚科的叶具有特殊的花环结构。在1927年，尚茨(H. L. Shantz)和L. N. Piemeisel发现，具有花环结构的植物合成单位干物质的耗水量只有其他植物的1/2左右。1944年，罗迪斯(M. M. Rhoades)和卡瓦略(A. Carvalho)在显微镜下观察到这类植物的淀粉仅集中在维管束鞘细胞里，而不像其他植物那样散布在叶肉细胞中。1962年，研究人员发现，具有花环结构的植物具有较低的CO2补偿点。1963年，发现具有花环结构的植物具有潜在的高生长效率。

期间在1952年，美国夏威夷食糖种植协会的科学家科思谢克(H.P.Kortschak)出于好奇，想了解C3途径是否也适合于甘蔗一类的植物。用14C标记二氧化碳，同样用双相纸层析和放射自显影技术进行检测，发现首先出现的放射性化合物并不是3-磷酸甘油酸。1956—1957年间，科思谢克发表文章表明，甘蔗叶中最早被标记的3种化合物中，首先是苹果酸和天冬氨酸，其次才是磷酸甘油酸[1]。同时，有学者在高粱中也发现了这种现象，这些植物都属于生活在热带的禾本科黍亚科植物。无独有偶，1960年，苏联科学家卡贝洛夫研究玉米叶片光合作用时，也发现CO2同化的最初产物为苹果酸和天冬氨酸，为之后C4途径的发现奠定了基础。

2 DNA及遗传信息表达研究中同位素标记法的应用

在格里菲斯(F. Griffith)肺炎双球菌转化实验提出转化因子后，埃弗里(O. T. Avery)从III型s型肺炎双球菌中分离得到了活性的转化因子，但当时由于许多科学家始终抱着在核酸中的少量污染物也许就是遗传物质这样一种希望，因此大量的工作都用于提纯这些转化因子。直到1952年，人们对DNA的作用问题仍然保持着谨慎态度。甚至当高纯度的DNA制备物只含有少于0.02%的蛋白质都被证明为对转化作用有效。直到赫尔希(A. Hershey)和蔡斯(M. Chase)进行的实验，为DNA是遗传物质提供了令人信服的证据。赫尔希开始进行这些实验时，对核酸进入细菌细胞的可能性是相当怀疑的。安德森(T. F. Anderson)记得，在冷泉港实验室的某一天，他和赫尔希讨论了一种“极其滑稽”的可能性，即只有病毒的DNA进入寄主细胞，并像转化因子一样改变了细胞的合成过程。

赫尔希和蔡斯用分别被35S或32P标记的T2噬菌体侵染未被放射性同位素标记的宿主菌，分离宿主菌和噬菌体，离心后测定宿主菌细胞的放射性。被35S标记的噬菌体，其放射性出现在宿主菌细胞的外面，被32P标记的噬菌体其放射性，主要集中在宿主菌细胞内。

与别的科学家不同的是，早在1951年沃森(J. Waston)就对DNA是遗传物质深信不疑，即想证明DNA是遗传物质。随后，沃森遇到了克里克(F. Crick)并利用富兰克林(R. Franklin) X衍射的资料，结合自己的猜想提出DNA反向平行的双螺旋结构模型。在沃森—克里克结构模型中，科学家可以推测到DNA“怎样在每一个细胞世代中自我复制”。而当时具有三种猜想：全保留复制，半保留复制以及弥散复制。直到1958年梅塞尔森(M. S. Meselson)和斯塔尔(F. Stahl)设计了DNA复制的放射性同位素标记实验，才明确DNA的复制方式为半保留复制。

他们利用15N标记的大肠杆菌作为实验材料，提取其中DNA，进行密度梯度离心，得到的条带表明：被标记的DNA15N/15N密度较大，位于离心管的下部，即重带。取被15N标记的大肠杆菌放入14NH4Cl为唯一氮源的培养液中，大肠杆菌分裂一次(20min)，DNA复制一次后取出，提取DNA进行密度梯度离心，得到的条带表明：只有一种密度的DNA(15N/14N)，且其密度较两条链均被15N标记的DNA小，位于离心管的中部，即中带。待大肠杆菌再分裂一代，即DNA再复制一次，进行相同的操作，得到的条带表明：此时有两种密度的DNA出现，其中一条带的DNA密度和复制一次的密度相同(15N/14N)，另一新条带，密度最小(14N/14N)，位于离心管的上部，即轻带。实验按照上述程序持续进行，在以后各代DNA中，密度梯度离心的结果均显示：有两种密度的DNA分子出现，且其密度和复制两次时的情形相同。

而在1955年，布拉切特(J. Brachet)用洋葱根尖和变形虫进行实验，发现如加入RNA酶，分解掉细胞内的RNA，蛋白质的合成就停止；如果再加入从酵母中提取出来的RNA，则会又重新合成一定数量的蛋白质。这表明蛋白质的合成与RNA直接相关。同年，戈尔茨坦(J. L. Golstein)和普劳特(Plaut)等用放射性同位素标记变形虫细胞核内的RNA，观察到标记的RNA从细胞核相继进入细胞质。因此，猜测RNA很可能是DNA和蛋白质合成之间的信使。

同年，利特菲尔德(Littlefield)对小鼠饲喂用14C标记的亮氨酸。不久将小鼠杀死，取出肝细胞并分离其组成成分。发现大部分14C标记的亮氨酸已掺入蛋白质，并且与核糖体有联系。为此，他首先提出了核糖体是合成蛋白质的场所。至此，放射性同位素标记法已将中心法则的核心内容一一证实。

随即又有科学家以T2噬菌体DNA为模板制成用32P标记的RNA，取一定量T2-DNA和其他种类的DNA加入此32P的RNA中，经加热使DNA双链打开，并温育，用密度梯度离心或微孔膜分离出DNA-32P RNA复合体测其放射性，实验结果只有菌体T2的DNA能与该32P标记的RNA形成放射性复合体。从而证实了RNA与DNA模板的碱基呈特殊互补配对关系[2]。

科学家又对鸟嘌呤核糖核苷酸(GMP)的碱基和核糖上分别都标记上14C，在离体系统中使之参入脱氧鸟嘌呤核苷酸(dGMP)，然后将原标记物和产物分别进行酸水解和层析分离后，测定它们各自的碱基和戊糖的放射性，结果发现它们两部分的放射性比值基本相等。证明了脱氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接转化而来的，并不是从头合成[3]。

此外，如动物原肠胚三胚层的发育、动物体内甲状腺的作用、确定胆固醇的体内合成途径实验、确定植物体内矿质元素运输的途径实验、植物体内吲哚乙酸的运输等生命科学实验，均利用了放射性同位素标记法。

3 小结

放射性同位素标记法的使用贯穿整个生命科学史，教师可将与同位素标记法有关的生物科学史有意识地引入到光合作用、遗传信息表达的教学中，将间接知识经验转化为具体的探究历程，从而调动学生思维的积极性，从多方面培养学生学习生物学的兴趣，促使学生勇于探索生命的规律，培养科学精神和创新意识。