郭晓丽，李二虎，宋雅东，钟武，王美玉，郭小，潘思轶

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）（2.武汉食品化妆品检验所，湖北武汉 430012）

生物胺是一类含氨基的芳香族、脂肪族及杂环类的低分子有机化合物，广泛存在于发酵和腐败食品中，大多数生物胺是通过微生物分泌的氨基酸脱羧酶催化特定的氨基酸脱羧而形成，少数是通过醛或酮氨基化形成[1～3]。低浓度的生物胺是生物体内不可缺少的生理活性物质[2,4]，然而摄入高浓度的生物胺可损害人体的神经系统和肠道，引起头疼、腹泻及呕吐等中毒症状，严重时甚至会危及生命[5～7]。此外，腐胺和尸胺能抑制组胺和酪胺相关代谢酶的活性，而增加组胺和酪胺的毒性，尸胺、腐胺、亚精胺及精胺也易与亚硝酸盐反应生成强致癌物质亚硝基胺[8～11]。食品中的生物胺含量也可以作为食品的新鲜或腐败程度的评价指标[12]。因此，食品中生物胺的定量测定对于有效监控食品的质量安全起到重要作用。

酱腌菜是以新鲜蔬菜为主要原料，经不同腌渍工艺制作而成的各种蔬菜制品的总称[13]。按传统分类方法酱腌菜可分为发酵型酱腌菜和非发酵型酱腌菜[14]。但这两类蔬菜腌渍品在腌渍过程中都存在着不同程度的发酵，可生成高浓度的生物胺[15～17]。目前国内外已有不少研究发现腌制蔬菜中存在高浓度的生物胺[16～20]。

目前食品中生物胺的检测方法很多，如离子色谱法（IC）[21]、气相-质谱串联色谱法（GC）[22]、薄层色谱法(TLC)[23]、毛细管电泳法(CSE)[24]、液相-质谱串联色谱法(LC-MS)[25]、高效液相色谱法（HPLC）等，其中HPLC因其独特的优势而应用最广[26,27]。由于大多数生物胺是缺乏紫外或荧光发色基团的极性分子，衍生化反应是其进行色谱分析的关键，衍生剂不仅可以标示出生物胺分子的氨基基团，还可以降低其极性而增大其在色谱柱中的分离效果，提高检测的灵敏度[28]。丹磺酰氯（DNS-Cl）作为衍生剂能与单、多胺反应，衍生产物稳定的特点而被广泛应用于测定食品中的生物胺，但DNS-Cl衍生法存在试剂消耗大、耗时长和操作复杂等缺点[17～19]。根据文献报道[29,30]，4-氟-3-硝基-三氟甲苯（FNBT）作为衍生剂除能与单、多胺反应，衍生产物稳定外，FNBT衍生法还具有高灵敏度等优点。然而该方法存在试剂消耗大、操作复杂、耗时长等问题，限制了在食品中生物胺的高效准确测定。而经优化建立的FNBT衍生法具有简单、快速、准确等优点，具有测定食品中生物胺的广泛应用前景[20]。但FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法测定生物胺比较的研究尚未见相关报道。因此，本文在FNBT衍生法研究的基础上[20,30]，分别用FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法测定酱腌菜中的8种生物胺（组胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺、亚精胺及精胺），比较这两种检测方法的差异性，完善FNBT衍生法的不足，以期获得更高效的酱腌菜中生物胺的测定方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

组胺、酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、色胺、精胺、亚精胺（纯度98%以上），丹磺酰氯（DNS-Cl），纯度为99%，美国Sigma公司；4-氟-3-硝基-三氟甲苯（FNBT），纯度为99%，N,N-二异丙基乙胺（DIPEA），纯度为99%，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、丙酮和甲醇为色谱纯，德国 Merck公司；H3BO3，Na2B4O7·10HO4，Na2CO3、NaOH、氨水和乙酸乙酯等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱仪 Dionex Ultimate 3000，戴安公司；Milli-Q超纯水处理器，美国Millipore公司；3-18K型高速冷冻离心机，德国sigma公司；微型旋蜗混合仪器，沪西分析仪器厂；24孔可调式氮吹仪，上海泉岛科贸有限公司；PHS-3E酸度计，上海雷磁仪器厂；恒温震荡水浴锅。

1.2 材料

市售酱腌菜样品，购自于武汉市东西湖区超市。

1.3 实验部分

1.3.1 标准溶液和试剂的配制

标准生物胺溶液：准确称取各标准品100 mg（精确到0.001 g），用0.1 mol/L盐酸溶解，并定容至100 mL得标准生物胺储备液(1 mg/mL)。分别准确移取8种生物按标准储备液混合均匀，再用0.1 mol/L盐酸稀释成终浓度分别为100、50、20、10、5、2、1 mg/L的标准混合溶液，4 ℃避光保存。

丹磺酰氯（DNS-Cl）衍生剂：称取1 g DNS-Cl，加入100 mL丙酮配制质量浓度为10 mg/mL的溶液，4 ℃冰箱贮藏。

4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）衍生剂：用甲醇稀释20倍，室温储藏。

1.3.2 样品提取

称取搅碎的酱腌菜样品5.0 g于50 mL的离心管中，加入20 mL、0.1 mol/L盐酸溶液超声30 min，离心（6000 r/min，10 min，4 ℃），移取上清液，再加入20 mL 0.1 mol/L盐酸溶液重复提取1次，合并上清液，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL。

1.3.3 FNBT衍生法

1.3.3.1 色谱条件

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

采用Agilent TC-C18色谱柱（4.6×250 mm×5 μm），紫外检测波长为242 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，流速为1.0 mL/min，梯度洗脱程序见表1。

1.3.3.2 FNBT衍生条件

在Tang[31]和Jastrzębska[30]的研究方法上改进，具体衍生过程参考[20]。

0.5 mL生物胺标准混合溶液或样品提取液，用H3BO3-Na2B4O7缓冲液调节 pH 为 9.5，加入 1 mL FNBT（稀释20倍）和20 μL DIPEA，置于60 ℃恒温震荡水浴锅，30 min后取出加入20 μL HCL(2 mol/L)终止反应，去除多余的 FNBT，混合均匀，静置反应5 min，用5 mL乙酸乙酯提取，离心（6000 r/min，10 min，4 ℃），收集上层有机相，重复提取3次，合并提取液，40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇溶解残留物，过0.22 μm有机滤膜，进行HPLC测定。

1.3.4 DNS-Cl衍生法

1.3.4.1 色谱条件

采用 Agilent TC-C18(色谱柱（4.6×250 mm×5 μm）)，紫外检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，进样量20 μL。流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，流速为1.0 mL/min，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.3.4.2 DNS-Cl衍生条件

在参考瞿凤梅等人[19]的研究方法上稍作修改，0.5 mL生物胺标准混合溶液或样品提取液，加300 μL饱和 Na2HCO3溶液，200 μL NaOH 溶液(2 mol/L)，1 ml DNS-Cl(10 mg/L)，置于60 ℃恒温震荡水浴锅（避光），30 min后取出加入200 μL氨水（1：1）终止反应，暗室下静置反应30 min(避光)，用5 mL乙酸乙酯提取，离心（6000 r/min，10 min，4 ℃），收集上层有机相，重复提取3次，合并提取液，40 ℃下氮气吹干，用l.0 mL甲醇溶解残留物，过0.22 μm有机滤膜，进行HPLC测定。

1.4 数据处理

用Excel 2007和SPSS 21.0软件对样品中生物胺的两种检测方法的结果进行数据处理，并比较分析两种检测方法的差异性，重复6次。

2 结果与分析

2.1 生物胺的色谱分离效果

图1和图2分别为FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法检测生物胺的 HPLC色谱图，生物胺标准品的HPLC色谱图分别见图1（a）和图2（a）。结果显示：8种生物胺在30 min内色谱峰完全分离，峰形对称，杂质干扰少。FNBT衍生法检测8种生物胺的出峰顺序依次为组胺，色胺，β-苯乙胺，腐胺，酪胺，尸胺，亚精胺，精胺。

图1 FNBT柱前衍生RP-HPLC检测生物胺的HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of biogenic amines by RP-HPLC with FNBT derivatization

图2 DNS-Cl柱前衍生RP-HPLC检测生物胺的HPLC色谱图Fig.2 The HPLC chromatograms of biogenic amines by RP-HPLC with DNS-Cl derivatization

DNS-Cl衍生法检测8种生物胺的出峰顺序依次为色胺，β-苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺，精胺。酱腌菜样品中生物胺的HPLC色谱图分别见图1（b）和图2（b）。

结果显示：同一样品，FNBT衍生法检测到样品中的8种生物胺，DNS-Cl衍生法只检测到样品中的7种生物胺，β-苯乙胺未被检出。说明FNBT衍生法对β-苯乙胺检测的灵敏度更高。

注：1.色胺；2.β-苯乙胺；3.腐胺；4.尸胺；5.组胺；6.酪胺；7.亚精胺；8.精胺。

2.2 两种方法的回归方程和检测限

由表3可知，FNBT和DNS-Cl衍生法检测8种生物胺时，8种生物胺在质量浓度为1.0～100 mg/L范围内具有显著的线性相关性，相关系数 R2均大于0.999。样品滤液衍生物用乙腈适当稀释，以信噪比(S/N)大于3和信噪比(S/N)大于10作为检出限和定量限的判断标准，结果见表3。8种生物胺的FNBT衍生法的检出限（0.016～0.071 mg/L）和定量限（0.053～0.236 mg/L）比 DNS-Cl衍生法的检出限（0.066～0.191 mg/L）和定量限（0.219～0.637 mg/L）低。说明FNBT衍生法对8种生物胺检测的灵敏度高于DNS-Cl衍生法。

表3 8种生物胺的回归方程和检测限Table 3 The regression equations and detection limits of eight biogenic amines

2.3 两种方法的精密度和加标回收率的比较

选择空白酱腌菜样品，添加4、15、25 mg/L三个水平质量浓度，分别按DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法做加标回收试验，每个水平平行测定6次。DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法的加标平均回收率和相对标准偏差（RSD）如表4和表5所示。

FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法测定酱腌菜中8种生物胺的平均回收率分别为 92.87%～100.18%和83.52%～102.33%，其中FNBT衍生法测定精胺的准确性（精胺的加标平均回收率为93.87%）优于DNS-Cl衍生法（精胺的加标平均回收率为 83.52%），FNBT衍生法测定精胺的加标回收率比DNS-Cl衍生法提高了10.35%。

两种方法的精密度由 RSD表示，分别为0.78%～4.27%和0.41%～4.16%，RSD均小于5%，说明两种方法均符合酱腌菜中生物胺的定量要求。

2.4 两种方法测定市售酱腌菜中生物胺种类和含量的比较

为了考察FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法对实际样品中生物胺含量检测结果的差异性，分别用已建立并优化的FNBT衍生法[20]和DNS-Cl衍生法，对采集的7个酱腌菜样品的生物胺含量和种类进行测定和分析，结果见表6。

表4 FNBT衍生法加标回收率试验结果Table 4 Results of the recovery testes by FNBT derivative method(n=6)

表6 DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法测定酱腌菜中生物胺的含量(mg/kg)Table 6 Contents of biogenic amines in pickled vegetable samples measured with FNBT and DNS-Cl derivative methods(mg/kg)

注：ND表示未检出；表中同一种酱腌菜样品中某一生物胺含量的不同字母代表这两种方法的检测结果存在显著差异（p＜0.05）。

对相同样品中同一生物胺FNBT和DNS-Cl衍生法的检测结果进行配对样本分析，结果发现两种方法均能满足酱腌菜中8种生物胺的检测，但这两种方法检测酱腌菜样品中总生物胺的含量存在显著差异（p＜0.05）。由样品3，6可知，对于色胺含量较低的酱腌菜样品FNBT衍生法能检测出，而DNS-Cl衍生法未检出，说明FNBT衍生法对色胺检测的灵敏度高于DNS-Cl衍生法。对7种酱腌菜样品中精胺及样品2、3、4、5酱腌菜样品中β-苯乙胺、腐胺及酪胺的检测分析，发现两种方法的检测结果差异性不显著。对相同酱腌菜样品中组胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺和亚精胺的检测，发现两种方法的检测结果存在显著差异（p＜0.05），FNBT衍生法检测组胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、亚精胺和精胺的含量均高于 DNS-Cl衍生法。说明 FNBT衍生法较DNS-Cl衍生法衍生效果更好，FNBT衍生法检测结果的准确性更可靠。

3 结论

3.1 本文比较了FNBT和DNS-Cl衍生法这两种方法的方法学参数，结果表明：两种方法均在30 min内完成8种生物胺的良好分离，各生物胺衍生物线性关系良好，FNBT衍生法的检出限（0.016～0.071 mg/L）优于DNS-Cl衍生法（0.066～0.191 mg/L），FNBT衍生法的加标平均回收率（92.87%～100.18%）略优于DNS-Cl衍生法的加标平均回收率（83.52%～102.33%），FNBT衍生法对8种生物胺检测的灵敏度高于DNS-Cl衍生法。

3.2 利用FNBT和DNS-Cl衍生法测定了7种不同市售酱腌菜样品中8种生物胺的含量，结果进行配对分析发现：对于色胺含量较低的酱腌菜样品FNBT衍生法能检测出，而DNS-Cl衍生法未检出。FNBT衍生法检测组胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺的含量均高于DNS-Cl衍生法。两种方法检测酱腌菜样品中的 8种生物胺存在显著差异（p＜0.05）。FNBT衍生法，衍生试剂消耗少、操作简便、快速、检出限低及灵敏度高优于DNS-Cl衍生法，具有测定食品中生物胺的广泛应用前景。